Per2節(jié)律基因?qū)549肺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響及其相關(guān)分子的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率和病死率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和特征，也是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的首要原因，約有30％的肺癌患者在首診時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，另有50%～60%在治療過程中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，80%～90%的肺癌死亡是由轉(zhuǎn)移引起[1,2]。而近年來時間生物學(xué)(Chronobiology)在肺癌研究領(lǐng)域的運(yùn)用為我們揭示肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制這一難題開辟新思路。生物鐘基因不僅參與調(diào)控正常細(xì)胞的各種生物學(xué)

2、行為，同樣也影響著腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，可能是一種腫瘤抑制基因。近年來生物鐘基因特別是Period基因已成為國內(nèi)外肺癌研究領(lǐng)域內(nèi)的一個新焦點(diǎn)[3-5]。研究提示Period基因參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)行為。目前已知可能抑制肺癌轉(zhuǎn)移的基因有CDH1，Nm23，KAI1和MTSl等?？赡芷鸫龠M(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移作用的基因有c-Myc，VEGF和CD44。但對于Period基因是否參與了對肺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控，國內(nèi)外目前還沒有

3、相關(guān)研究。
　　目的探尋Per2基因在人肺癌中侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用和意義。
　　方法體外實(shí)驗(yàn)構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-Per2，慢病毒包裝，并采用慢病毒轉(zhuǎn)染人A549肺癌細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞株，RT-PCR和Western Blotting法鑒定過表達(dá)Per2基因表達(dá)。改良Boyden小室法和劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外侵襲遷移能力的變化。RT-PCR和Western Blotting法檢測NM23

4、、VEGF、C-MYC、CDH1和CD44基因和蛋白的表達(dá)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測皮下移植瘤中Per2，Nm23和CDH1的表達(dá)水平。通過裸鼠尾靜脈注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠A549肺癌細(xì)胞侵襲遷移模型，解剖兩組裸鼠的腦、肺、肝和腎上腺組織，進(jìn)行HE染色，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)：RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)OE(over-expressed)組比NC(negative control)組Per2基因表達(dá)量

5、高出11倍。Western blotting結(jié)果也顯示OE組較NC組Per2基因表達(dá)量明顯提高，并通過灰度定量分析，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0425）。體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NC組細(xì)胞穿透小室的平均細(xì)胞數(shù)為134.2±7.165和130.8±9.987。OE組細(xì)胞穿透小室的平均細(xì)胞數(shù)為56.80±6.763和20.20±4.164,NC組明顯高于OE組（P＜0.0001和P＜0.0001）。劃痕實(shí)驗(yàn)NC基因組細(xì)胞平均遷移距

6、離為452.8±5.279像素，OE細(xì)胞平均遷移距離315.4±5.743像素，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。RT-PCR和Western blotting結(jié)果也表明OE組細(xì)胞的VEGF、CD44和c-Myc基因的表達(dá)和蛋白水平明顯低于NC組，CDH1和Nm23的表達(dá)水平明顯增高（P值均小于0.05）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：皮下移植瘤免疫組化發(fā)現(xiàn)：OE組中Nm23和CDH1的表達(dá)水平高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0383和0

7、.0232）。
　　結(jié)論 Per2基因明顯降低了A549腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力。Per2基因通過調(diào)節(jié)與腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因來抑制A549腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力。其中，Per2基因下調(diào)A549細(xì)胞中的促腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因，如VEGF、CD44和c-Myc基因的表達(dá)水平，上調(diào)抑腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因，如Nm23和CDH1。本實(shí)驗(yàn)為深入研究Per2基因影響肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和信號通路奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義，并可為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的診