FANCD2 shRNA干擾對(duì)頭頸鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞放療敏感性影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)能長(zhǎng)期有效、穩(wěn)定的沉默頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squarecell carcinoma，HNSCC)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HSC-4細(xì)胞FANCD2基因的表達(dá)。shRNA干擾沉默HSC-4細(xì)胞FANCD2基因表達(dá)后，通過調(diào)控HSC-4細(xì)胞放射治療后的增殖、凋亡及細(xì)胞周期從而提高其對(duì)放射治療的敏感性，并初步闡明了其放療增敏機(jī)制可能與

2、激活p38絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，并通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2的表達(dá)有關(guān)。本課題在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討FANCD2 shRNA干擾對(duì)HSC-4細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)及放療敏感性的影響，并研究其可能存在的機(jī)制，為FANCD2成為HNSCC治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：以課題組前期實(shí)驗(yàn)獲得的FANCD2基因沉默效應(yīng)

3、穩(wěn)定的HSC-4細(xì)胞為研究對(duì)象，建立裸鼠皮下移植瘤模型。將15只雌性BALB/c-nu裸鼠編號(hào)后按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組:FANCD2-shRNA（接種轉(zhuǎn)染FANCD2有效干擾序列且沉默效應(yīng)穩(wěn)定的HSC-4細(xì)胞），陰性對(duì)照組:FANCD2-shRNA-C（接種轉(zhuǎn)染FANCD2無(wú)效干擾序列的HSC-4細(xì)胞），空白對(duì)照組:HSC-4（接種未經(jīng)任何處理的野生型HSC-4細(xì)胞）。通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察三組細(xì)胞成瘤率、成瘤時(shí)間及瘤

4、體生長(zhǎng)情況;于HSC-4細(xì)胞接種28天后行裸鼠皮下移植瘤瘤體局部常規(guī)分割放療，2Gy/次，1次/天，連續(xù)5天，觀察放療后三組瘤體體積變化情況，繪制瘤體體積生長(zhǎng)曲線;于放療結(jié)束后的第10天用頸椎脫臼法處死裸鼠，迅速完整剝離瘤體，稱取瘤體重量，計(jì)算腫瘤抑瘤率;瘤體常規(guī)病理HE染色，觀察瘤體病理學(xué)特點(diǎn);DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End

5、Labeling,TUNEL)檢測(cè)瘤體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡情況;免疫組化Envision法(Immunohistochemistry, IHC)及免疫印跡(Western Blot，WB)檢測(cè)瘤體放療后Bax、Bcl2、p38和p-p38蛋白表達(dá)的變化，探討FANCD2 shRNA干擾對(duì)HSC-4細(xì)胞放療敏感性的影響與Bax、Bcl2、p38和p-p38蛋白表達(dá)的關(guān)系及其可能存在的機(jī)制。
　　結(jié)果：⑴HSC-4細(xì)胞裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

6、示:三組的15只裸鼠均形成肉眼可見的瘤塊，成瘤率100％;與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下移植瘤成瘤時(shí)間延長(zhǎng)、生長(zhǎng)減緩、瘤體體積及重量明顯減小。實(shí)驗(yàn)組HSC-4細(xì)胞成瘤時(shí)間為9～10天，中位時(shí)間10天;陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組成瘤時(shí)間為5～7天，中位時(shí)間6天。放療前實(shí)驗(yàn)組瘤體體積為57.88±5.12mm3，顯著低于陰性對(duì)照組89.95±7.44mm3與空白對(duì)照組98.83±6.31mm3(F=56.474，P＜0.05);放療后實(shí)驗(yàn)組瘤體體

7、積為11.11±5.25mm3，顯著低于陰性對(duì)照組57.96±11.36mm3與空白對(duì)照組67.42±4.40mm3(F=77.466，P＜0.05)，且實(shí)驗(yàn)組放療后瘤體體積縮小了46.77±2.76mm3，顯著多于陰性對(duì)照組31.41±3.52mm3與空白對(duì)照組31.09±7.69mm3(F=15.206，P＜0.05);放療后實(shí)驗(yàn)組瘤體重量0.034±0.015g顯著低于陰性對(duì)照組0.092±0.023g與空白對(duì)照組0.100±0.

8、045g(F=6.950，P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組瘤體重量抑瘤率為66.00±15.17％，體積抑瘤率為83.52±7.78％;瘤體HE染色見腫瘤細(xì)胞成巢狀分布，可見環(huán)狀紅染的角化珠和細(xì)胞間橋，細(xì)胞異形性明顯，核分裂象多見，符合鱗癌的病理學(xué)特點(diǎn)。⑵TUNEL結(jié)果顯示:放療后三組瘤體均有不同程度的凋亡細(xì)胞，但實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組的凋亡指數(shù)AI(apoptotic index，AI)為56.02±6.51％，

9、顯著高于陰性對(duì)照組30.80±4.47％與空白對(duì)照組26.22±5.82％(F=80.216，P＜0.05)。⑶IHC結(jié)果顯示:放療后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組Bax、 p-p38蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl2、 p38蛋白表達(dá)顯著降低;實(shí)驗(yàn)組Bax蛋白的平均光密度（mean optical density, MOD）值為0.190±0.022，顯著高于陰性對(duì)照組0.168±0.015與空白對(duì)照組0.163±0.012(F=6.594，P＜0.05)

10、;實(shí)驗(yàn)組p-p38蛋白的MOD值為0.224±0.015，顯著高于陰性對(duì)照組0.173±0.016與空白對(duì)照組0.165±0.015(F=20.778，P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組Bcl2蛋白的MOD值為0.147±0.013，顯著低于陰性對(duì)照組0.176±0.012與空白對(duì)照組0.168±0.008（F=16.137, P＜0.05）;實(shí)驗(yàn)組p38蛋白的MOD值為0.161±0.016，顯著低于陰性對(duì)照組0.191±0.010與空白對(duì)照組0

11、.200±0.029(F=15.330，P＜0.05)。⑷WB結(jié)果顯示:放療后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組Bax、p-p38蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl2、p38蛋白表達(dá)顯著降低;實(shí)驗(yàn)組Bax蛋白的灰度值為0.219±0.008，顯著高于陰性對(duì)照組0.089±0.005與空白對(duì)照組0.091±0.005(F=6.594，P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組p-p38蛋白的灰度值為0.129±0.005，顯著高于陰性對(duì)照組0.020±0.004與空白對(duì)照組0.024±

12、0.004(F=652.917，P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組Bcl2蛋白的灰度值為0.053±0.005，顯著低于陰性對(duì)照組0.097±0.013與空白對(duì)照組0.105±0.008(F=25.200,P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組p38蛋白的灰度值為0.021±0.002，顯著低于陰性對(duì)照組0.215±0.007與空白對(duì)照組0.233±0.006(F=1314.201，P＜0.05)。
　　結(jié)論：①FANCD2 shRNA干擾延長(zhǎng)了HSC-4細(xì)

13、胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤時(shí)間，并抑制HSC-4細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng);②FANCD2 shRNA干擾降低了放療后裸鼠HSC-4細(xì)胞移植瘤瘤體的體積和重量，增加了放療后裸鼠HSC-4細(xì)胞的抑瘤率，促進(jìn)了放療引起的HSC-4細(xì)胞凋亡，即在活體內(nèi)FANCD2 shRNA干擾提高了HSC-4細(xì)胞對(duì)放療的敏感性;③FANCD2 shRNA干擾對(duì)裸鼠HSC-4細(xì)胞移植瘤的放療增敏機(jī)制與激活p38 MAPK信號(hào)通路，并通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2的表