FANCD2 shRNA干擾對(duì)頭頸鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞HSC-4放療敏感性的影響和機(jī)制研究.pdf

1、目的:頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC)是臨床上常見的惡性腫瘤。HNSCC特別是鼻咽癌(NasopharyngealCarcinoma，NPC)98％屬于低分化鱗狀細(xì)胞癌，首選放射治療。然而，對(duì)于局部復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和初次治療失敗的患者單純放療療效較差，特異性高、靶向性強(qiáng)的放療增敏技術(shù)及方法急需研發(fā)。課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明FANCD2 shRNA干擾沉默F(xiàn)ANCD2基

2、因表達(dá)后可通過影響HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞HSC-4的體外生長(zhǎng)增殖、凋亡、細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白的表達(dá)提高HSC-4細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。但關(guān)于FANCD2基因是否參與了HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞HSC-4對(duì)放射治療敏感性的調(diào)控尚不得而知。本研究以FANCD2 shRNA干擾獲得的FANCD2穩(wěn)定沉默HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞HSC-4為研究對(duì)象，研究HSC-4細(xì)胞放療后細(xì)胞體外增殖抑制效應(yīng)、凋亡率、細(xì)胞周期分布、存活率及相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

3、，探討沉默F(xiàn)ANCD2對(duì)HSC-4細(xì)胞放療敏感性的影響及可能機(jī)制。
　　方法:以前期實(shí)驗(yàn)獲得FANCD2沉默效應(yīng)穩(wěn)定的HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞HSC-4為研究對(duì)象，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為三組，實(shí)驗(yàn)組:FANCD2-shRNA（轉(zhuǎn)染含F(xiàn)ANCD2有效干擾序列且FANCD2沉默效應(yīng)穩(wěn)定的HSC-4細(xì)胞），空白對(duì)照組:HSC-4（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HSC-4細(xì)胞），陰性對(duì)照組:FANCD2-shRNA-C（轉(zhuǎn)染FANCD2無效干擾序列的HSC-4細(xì)胞

4、）。三組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)過程中以嘌呤霉素篩選。通過細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測(cè)三組HSC-4細(xì)胞在不同劑量及不同作用時(shí)間鈷60照射后生長(zhǎng)增殖的情況，流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinⅤ-FITC/PI染色法）測(cè)定三組HSC-4細(xì)胞鈷60照射后凋亡率和細(xì)胞周期改變，克隆形成法檢測(cè)三組HSC-4細(xì)胞放療后的存活率，以研究FANCD2 shRNA干擾對(duì)HSC-4細(xì)胞放療敏感性的影響;通

5、過Western Blot法檢測(cè)FANCD2 shRNA干擾以及放療后Bax、Bcl-2、p-38和p-p-38蛋白表達(dá)的變化，探討FANCD2與Bax、Bcl-2、p-38和P-p-38蛋白表達(dá)的關(guān)系，研究FNACD2 shRNA干擾影響HSC-4細(xì)胞放療敏感性的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:(1) CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示隨著放療劑量加大三組細(xì)胞增殖抑制率均提高，且實(shí)驗(yàn)組在各劑量照射后的增殖抑制效應(yīng)均強(qiáng)于對(duì)照組(P＜0.05)，其中在放

6、療劑量增加至8Gy時(shí)實(shí)驗(yàn)組吸光度值(OD)（0.256±0.027）明顯低于陰性對(duì)照組（0.362±0.008）和空白對(duì)照組（0.382±0.0213），增殖抑制作用最強(qiáng)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.835，P＜0.05);照射劑量為5Gy作用24、48、72小時(shí)后，三組細(xì)胞增殖水平均隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，照射后24、48、72小時(shí)各細(xì)胞組間OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)值分別為(F=6.307，P＜0.05)、(F=9.007，

7、P＜0.05)和(F=22.914，P＜0.05)，且實(shí)驗(yàn)組增殖抑制效應(yīng)較對(duì)照組更強(qiáng);(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示8Gy放射治療后細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率（34.074±0.061）％明顯高于陰性對(duì)照組(5.926±0.038)％和空白對(duì)照組（14.241±0.047）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=261.786，P＜0.05)，即說明shRNA干擾沉默F(xiàn)NACD2后HSC-4細(xì)胞由放療誘導(dǎo)的凋亡率增加;(3) shRNA干擾

8、沉默F(xiàn)ANCD2后，三組細(xì)胞放射治療后48小時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期變化為進(jìn)入S期比例增加（F=160.778，P＜0.05），進(jìn)入G0/G1期細(xì)胞減少(F=224.974，P＜0.05)，G2/M期比例無明顯差異(F=2.664，P＞0.05)，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(4)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著放療劑量加大，各組細(xì)胞存活率均降低且各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，放療劑量增加至8Gy時(shí)shR

9、NA干擾組細(xì)胞存活率（0.007±0.021）較空白對(duì)照組（0.039±0.013）和陰性對(duì)照組（0.037±0.016）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.671，P＜0.05）。(5)Western Blot結(jié)果表明shRNA干擾沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Bax(F=931.591，P＜0.05)和p-p38(F=685.425，P＜0.05)蛋白表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)，p-38（F=1954.140，P＜0.05）和Bcl-2

10、(F=3219.791，P＜0.05)蛋白表達(dá)降低;各組細(xì)胞放射治療后，實(shí)驗(yàn)組Bax(F=429.591，P＜0.05)和p-p38(F=214.974，P＜0.05)蛋白表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)，p-38(F=1027.974，P＜0.05)和Bcl-2(F=285.974，P＜0.05)蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低。
　　結(jié)論:(1) FANCD2 shRNA干擾能提高人HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HSC-4細(xì)胞放療后的增殖抑制效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞由放療

11、誘導(dǎo)的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，降低細(xì)胞存活率，即shRNA干擾沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)能提高人HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞HSC-4對(duì)放射治療的敏感性;(2) FANCD2基因沉默可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)通路Bax/bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)HSC-4細(xì)胞放療誘導(dǎo)的凋亡，并通過激活p-38MAPK通路，導(dǎo)致p-p-38蛋白表達(dá)增強(qiáng)，共同參與HSC-4細(xì)胞放射治療后細(xì)胞增殖，凋亡、細(xì)胞周期分布的調(diào)控從而提高人HNSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞HSC-4