microRNa-188作用于靶基因SIX1負(fù)調(diào)控ERK信號(hào)通路抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖侵襲.pdf

1、目的：摸索SIX1、miR-188在口腔鱗癌組織細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)及其所能具有的能力。分析SIX1在口腔鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮其作用所依賴的信號(hào)通路以及miR-188在口腔鱗癌細(xì)胞中的潛在分子機(jī)制。
　　方法：原發(fā)性腫瘤樣本、口腔鱗癌新鮮組織以及相對(duì)應(yīng)的臨近的健康組織進(jìn)行免疫組織化學(xué);細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;Western blot;集落形成實(shí)驗(yàn);MTT實(shí)驗(yàn);流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期;基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn);熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)。
　　

2、結(jié)果：1.SIX1在口腔鱗癌中的表達(dá):正常的口腔上皮細(xì)胞里是沒(méi)有SIX1表達(dá)陽(yáng)性染色的。在80例的口腔鱗癌病理樣本里有32例的SIX1呈現(xiàn)細(xì)胞核和細(xì)胞漿陽(yáng)性反應(yīng)。2.SIX1對(duì)于口腔鱗癌的臨床意義:SIX1的過(guò)度表達(dá)同較高的TNM分級(jí)，瘤體不同時(shí)期以及是否有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。3.SIX1促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲:Detroit562細(xì)胞系內(nèi)源增殖數(shù)量偏大，KB細(xì)胞系內(nèi)源增殖數(shù)量偏小。SIX1轉(zhuǎn)染后能夠顯著上調(diào)SIX1信使RNA以

3、及相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)量，siRNA基因干擾則能起到相反的作用。MTT發(fā)現(xiàn)SIX1轉(zhuǎn)染能夠增強(qiáng)KB細(xì)胞系的增殖能力，經(jīng)過(guò)siRNA處理的Detroit562細(xì)胞系則阻礙細(xì)胞增殖。transwell實(shí)驗(yàn)證明了，SIX1干擾后細(xì)胞的增殖浸潤(rùn)弱化而SIX1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖浸潤(rùn)顯著增強(qiáng)。4.SIX1調(diào)控cyclin D1以及MMP-2:SIX1轉(zhuǎn)染能夠顯著提高cyclin D1以及MMP-2蛋白合成，SIX1干擾則抑制了這些蛋白的合成。5.SIX1

4、通過(guò)ERK信號(hào)通路調(diào)控MMP-2:SIX1過(guò)表達(dá)能夠明顯提高ERK的磷酸化能力，相反對(duì)于JNK和p38的磷酸化能力不產(chǎn)生改變。6.SIX1調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化:SIX1過(guò)度表達(dá)能夠降低KB細(xì)胞群內(nèi)E-cadherin的含量水平，相反SIX1干擾會(huì)略提高E-cadherin的含量水平。同時(shí)SIX1對(duì)Snail和Twist蛋白質(zhì)的表達(dá)還具有正向調(diào)控作用。7.miR-188在口腔鱗癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào):口腔鱗癌病理組織內(nèi)miR-188的含量顯著下調(diào)。

5、口腔鱗癌病理組織細(xì)胞中miR-188含量較相應(yīng)的健康部分為少，比值為0.457。8.miR-188在體外細(xì)胞系中的表達(dá):Detroit562細(xì)胞群內(nèi)miR-188的含量并不高，而FaDu細(xì)胞群內(nèi)miR-188的含量略高。miR-188 mimic轉(zhuǎn)染能夠顯著上調(diào)Detroit562細(xì)胞系中miR-188的表達(dá)量;但是miR-188抑制劑能夠顯著下調(diào)FaDu細(xì)胞系中miR-188的含量。9.miR-188在體外能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖和侵襲:m

6、iR-188 mimic轉(zhuǎn)染后Detroit562細(xì)胞系集落形成數(shù)目顯著降低，miR-188抑制劑轉(zhuǎn)染后FaDu細(xì)胞系集落形成數(shù)目顯著增加。基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)中Detroit562細(xì)胞系中外源性miR-188含量增加，穿過(guò)基底膠的細(xì)胞總量明顯降低。miR-188抑制劑轉(zhuǎn)染FaDu細(xì)胞系，穿過(guò)基質(zhì)膠到達(dá)上層的細(xì)胞數(shù)目明顯增加。10.miR-188在體外能夠調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程:經(jīng)過(guò)miR-188 mimic轉(zhuǎn)染后能夠抑制細(xì)胞由G1向S轉(zhuǎn)變，經(jīng)過(guò)m

7、iR-188抑制劑處理的細(xì)胞系能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的轉(zhuǎn)變。11.miR-188上調(diào)cyclin D1，cyclin E和MMP9蛋白的表達(dá)量:經(jīng)過(guò)miR-188 mimic轉(zhuǎn)染后能夠顯著下調(diào)cyclin D1，cyclin E和MMP9的表達(dá)量，miR-188抑制劑轉(zhuǎn)染能夠明顯上調(diào)以上蛋白質(zhì)的表達(dá)量。12.miR-188負(fù)調(diào)控致癌基因SIX1:Detroit562細(xì)胞系轉(zhuǎn)染后，miR-188的過(guò)量表達(dá)能夠顯著減少SIX1信使RNA的表達(dá)

8、量。13.SIX1為miR-188作用的直接靶基因:載有野生型SIX1基因的Detroit562細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)miR-188mimic的轉(zhuǎn)染之后，熒光含量測(cè)定呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，而載有突變型SIX1基因的Detroit562細(xì)胞系中熒光強(qiáng)度則沒(méi)有明顯變化。表明SIX1基因的3'端非編碼區(qū)域是miR-188的直接結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)這樣的結(jié)合下調(diào)SIX1信使RNA的表達(dá)量。miR-188與SIX1信使RNA表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。SIX1基因干擾后發(fā)現(xiàn):

9、SIX1能夠消除siRNA SIX1對(duì)于cyclin D1以及MMP9蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)的影響。在SIX1基因沉默的FaDu細(xì)胞系中，使用miR-188抑制劑也未能上調(diào)cyclin D1以及MMP9蛋白質(zhì)的表達(dá)量。
　　結(jié)論：1.SIX1于人類口腔鱗癌病理組織中呈過(guò)量表達(dá)。2.SIX1的過(guò)表達(dá)對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)有促進(jìn)作用。3.SIX1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)的作用機(jī)制為ERK-MMP-2信號(hào)傳導(dǎo)以及上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化(EMT)。4.m