椎體血管異常的克隆性分析及蛋白表達(dá)、Tie2基因突變的差異研究.pdf

1、目的：⑴基于X染色體失活的嵌合性和X連鎖雄激素受體基因的多態(tài)性，運(yùn)用巢式PCR技術(shù)進(jìn)行克隆性分析，明確椎體血管異常的病變性質(zhì)為單克隆性的血管腫瘤亦或多克隆性的血管畸形。⑵檢測(cè)血管瘤、血管畸形GLUT1、Ki-67、VEGF、bFGF、uPA、MMP2及Tie2基因通路相關(guān)蛋白表達(dá)差別，探討椎體血管瘤和血管畸形的免疫組織化學(xué)特征，為難以鑒別的椎體血管異常提供免疫組織化學(xué)依據(jù)。⑶Tie2基因突變與血管畸形關(guān)系密切，本研究運(yùn)用RT-PCR技術(shù)

2、，對(duì)血管瘤和血管畸形進(jìn)行Tie2基因突變及mRNA檢測(cè)，比較兩者的基因變化特點(diǎn)，探討Tie2基因突變?cè)谧刁w血管畸形發(fā)病中的作用及機(jī)制。通過(guò)上述研究為椎體血管異常的正確診斷和治療方法的選擇提供理論依據(jù)。
　　方法：①運(yùn)用激光顯微切割技術(shù)捕獲血管異常組織，提取血管異常組織的DNA，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），根據(jù)女性X染色體失活的嵌合性及與X染色體連鎖的雄激素受體（AR）基因位點(diǎn)的多態(tài)性，對(duì)血管異常進(jìn)行克隆性分析，明確椎體血管異常為單

3、克隆性的血管腫瘤亦或多克隆性的血管畸形。②用免疫組化的方法，比較GLUT1、Ki-67、VEGF、bFGF、uPA、MMP2及Tie2基因通路相關(guān)蛋白（Tie2、Ang1、Ang2、Akt、PI3K）在血管瘤和血管畸形中表達(dá)的差異，尋找用于鑒別椎體血管瘤和血管畸形的特異性免疫標(biāo)記物，探索Tie2基因通路相關(guān)蛋白在椎體血管異常發(fā)病中的作用。③提取血管瘤和血管畸形的DNA和RNA，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)后測(cè)序，檢測(cè)Tie2基因突變點(diǎn)，探索

4、椎體血管畸形與Tie2基因突變的關(guān)系。④運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)血管瘤及血管畸形Tie2基因mRNA，比較血管瘤及血管畸形Tie2基因mRNA表達(dá)水平的差異，并進(jìn)一步了解Tie2基因突變是否影響Tie2 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴經(jīng)克隆性分析結(jié)果顯示，椎體及軟組織血管畸形AR基因酶切后擴(kuò)增出兩條帶，可能為多克隆性的非腫瘤性病變；增殖期血管瘤AR基因經(jīng)酶切后兩條帶中一條帶明顯減弱或消失，可能為單克隆性的腫瘤性病變。⑵用免疫組

5、化的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示GLUT1、Ki-67、VEGF、bFGF、uPA、MMP2、PI3K和Akt在增殖期血管瘤中的表達(dá)均顯著高于血管畸形，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；GLUT1、Ki-67和VEGF在椎體血管瘤中的表達(dá)均高于椎體血管畸形，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑶Tie2和Ang2在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)率較高，而Ang1在血管瘤和血管畸形中的表達(dá)率較低，Tie2、Ang1和Ang2的表達(dá)失衡。⑷在60例

6、軟組織血管畸形中檢測(cè)到了2種Tie2基因有意義突變，2690A＞G（Y897C）、2740C＞T（L914F），2種無(wú)意義突變，2763G＞A、2688C＞T；并且我們首次在椎體血管畸形中檢測(cè)到了Tie2基因突變2743C＞T（R915C）；在所有血管異常組織的DNA樣本及血管瘤中未檢測(cè)到Tie2基因突變。⑸Tie2 mRNA在血管畸形中的表達(dá)水平顯著低于血管瘤，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在血管畸形中突變型Tie2 mRNA的

7、表達(dá)水平顯著高于野生型（P＜0.05）；Tie2 mRNA在椎體血管畸形和軟組織血管畸形中的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：①絕大多數(shù)椎體血管異常為多克隆性的血管畸形，而非真性腫瘤。②GLUT1、Ki-67、VEGF、bFGF、uPA、MMP2、PI3K、Akt蛋白在增殖期血管瘤中表達(dá)較高，在血管畸形中表達(dá)較低，這些蛋白可能有助于椎體血管瘤和血管畸形的鑒別，其中GLUT1和Ki67特異性更好。③Tie2、An