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文檔簡介
1、目的:
1.觀察大鼠局灶腦缺血/再灌注后骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)能否動(dòng)員至外周血進(jìn)而歸巢到缺血腦區(qū);
2.探究電針能否上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs、CD34+EPCs數(shù)量;
3.探究電針能否促進(jìn)局灶腦缺血/再灌注大鼠缺血大腦皮質(zhì)區(qū)的血管再生;
4.探究電針可否通過介導(dǎo)eNOS促局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓VEGFR2+EPCs、CD34+EPCs動(dòng)員至外周血;
2、r> 5.探究電針可否通過介導(dǎo)eNOS促局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)的血管再生。
方法:
采用線栓法制備局灶腦缺血/再灌注SD大鼠模型。90只SD雄性大鼠完全隨機(jī)分為模型+生理鹽水組、模型+DIL-acLDL組。熒光共聚焦技術(shù)于骨髓腔內(nèi)注射DIL-acLDL后的1d觀察骨髓內(nèi)細(xì)胞攝取DIL-acLDL的情況;1d、2d、3d、7d觀察骨髓、外周血CD34+DIL-acLDL+雙陽性細(xì)胞及缺血大腦皮質(zhì)區(qū)DIL
3、-acLDL+陽性細(xì)胞表達(dá)情況。160只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組(N組)、假手術(shù)組(S組)、模型組(I/R組)、模型+電針組(I/RE組)、模型+電針+L-NAME組(I/REL組)。除N組外的各組局灶腦缺血1.5h后分為再灌注1d、2d、3d、7d四個(gè)亞組,每個(gè)亞組10只大鼠。選擇“百會(huì)”穴(GV20)及左側(cè)“四關(guān)”穴(合谷LI4/太沖LR3)為針刺穴位,刺激時(shí)間為20min,每日1次。流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血及骨髓中CD34+EPCs
4、、VEGFR2+EPCs數(shù)量,酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)測定外周血中eNOS蛋白的表達(dá),熒光定量PCR技術(shù)檢測缺血大腦皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA的表達(dá),免疫組織化學(xué)法檢測缺血大腦皮質(zhì)區(qū)VEGFR2蛋白表達(dá)及CD34標(biāo)記的微血管計(jì)數(shù),免疫組織化學(xué)法檢測缺血大腦皮質(zhì)eNOS蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:
1.生理鹽水組熒光共聚焦結(jié)果為陰性,DIL-acLDL組1d后骨髓腔內(nèi)觀察到紅色標(biāo)記的DIL-acLDL+細(xì)胞,并分別于1
5、d、2d、3d、7d后在骨髓及外周血中觀察到CD34+DIL-acLDL+雙陽性細(xì)胞,在缺血大腦皮質(zhì)區(qū)未檢測到DIL-acLDL+細(xì)胞。
2.大鼠骨髓CD34+EPCs、VEGFR2+EPCs數(shù)量變化情況
大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d、3d I/R組骨髓內(nèi)CD34+EPCs數(shù)量逐漸減少,但均明顯高于S組(P<0.01),I/RE組在各時(shí)間點(diǎn)與I/R組比較均顯著增高(P<0.01), eNOS抑制后骨髓內(nèi)CD
6、34+EPCs數(shù)量相比I/RE組則顯著降低(P<0.01)。大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d I/R組骨髓VEGFR2+EPCs數(shù)量明顯高于N組(P<0.01),7d時(shí)與N組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),I/RE組在各時(shí)間點(diǎn)與I/R組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01,P<0.05),而I/REL組的VEGFR2+EPCs數(shù)量相比I/RE組則顯著降低(P<0.01)。
3.大鼠外周血CD34+EPCs、VEGFR2+
7、EPCs數(shù)量變化情況
大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d、3d I/R組外周血CD34+EPCs數(shù)量明顯高于S組(P<0.01),I/RE組在各時(shí)間點(diǎn)與I/R組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),而I/REL組的CD34+EPCs數(shù)量相比I/RE組則顯著降低(P<0.01)。大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d I/R組外周血VEGFR2+EPCs數(shù)量明顯高于N組(P<0.01),7d時(shí)與N組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0
8、.05),I/RE組在各時(shí)間點(diǎn)與I/R組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01,P<0.05),而I/REL組的VEGFR2+EPCs數(shù)量相比I/RE組則顯著降低(P<0.01)。
4.外周血eNOS的蛋白表達(dá)情況
大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后I/R組1d、2d、3d外周血eNOS蛋白表達(dá)量明顯高于S組(P<0.01);I/RE組在各時(shí)間點(diǎn)與I/R組相比增高均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);而I/REL組的eNOS蛋白表
9、達(dá)量相比I/RE組則顯著降低(P<0.01)。
5.大鼠局灶腦缺血皮質(zhì)區(qū)CD34微血管計(jì)數(shù)
與I/R組比較,I/RE組各時(shí)間點(diǎn)CD34微血管計(jì)數(shù)均顯著增多(P<0.01),在eNOS被抑制后電針促腦內(nèi)血管再生的作用顯著降低(P<0.01)。
6.大鼠局灶腦缺血皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA表達(dá)及VEGFR2+細(xì)胞表達(dá)情況
大腦缺血皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA的表達(dá)量及VEGFR2+細(xì)胞表達(dá)均隨著缺血
10、時(shí)間的推移逐漸增高,與N組比較,I/R組各時(shí)間點(diǎn)VEGFR2+細(xì)胞表達(dá)均增高( P<0.01);I/RE組各時(shí)間點(diǎn)VEGFR2 mRNA的表達(dá)量及VEGFR2+細(xì)胞表達(dá)較I/R組均明顯增高(P<0.01);當(dāng)eNOS被阻斷后,電針促VEGFR2 mRNA及VEGFR2+細(xì)胞表達(dá)作用則明顯降低(P<0.01)。
7.缺血大腦皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白表達(dá)情況
大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1d、2d、3d缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS+細(xì)胞
11、數(shù)量量明顯高于S組(P<0.01);I/RE組在各時(shí)間點(diǎn)與I/R組相比增高均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);而I/REL組的eNOS+細(xì)胞數(shù)量相比I/RE組則顯著降低(P<0.01)。
結(jié)論:
1. DIL-acLDL可標(biāo)記活體大鼠骨髓腔內(nèi)細(xì)胞,且骨髓腔內(nèi)EPCs可動(dòng)員至外周血;
2.電針可動(dòng)員局灶腦缺血/再灌注大鼠內(nèi)源性EPCs促大鼠缺血腦區(qū)血管再生,該作用在eNOS被抑制后減弱,推測電針動(dòng)員EPCs促血
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