Mesothelin抗體修飾的Fe3O4@SiO2納米探針在胰腺癌體內(nèi)外靶向成像中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰腺癌(Pancreatic cancer，PC)早期癥狀不典型，侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，對(duì)目前主要的治療手段不敏感，預(yù)后差，五年生存率接近5％。超過(guò)80％的患者在確診為胰腺癌時(shí)已處于疾病的晚期階段，失去手術(shù)切除的時(shí)機(jī)。分子影像學(xué)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，分子影像學(xué)的技術(shù)和方法可用于胰腺癌的早期診斷及治療，有望早期精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)胰腺癌，及時(shí)診斷、治療，改善預(yù)后。需要指出的是，目前的研究大多限于實(shí)驗(yàn)室及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究中提出的一些胰腺癌新型靶向標(biāo)志物仍處

2、于探索階段，尚未能應(yīng)用于臨床。CA19-9是在臨床上唯一得到廣泛應(yīng)用的胰腺癌標(biāo)志物，但是其診斷胰腺癌的特異性及敏感性不高，僅具有一定的提示價(jià)值，或用于觀察胰腺癌患者對(duì)治療的反應(yīng)等。間皮素(Mesothelin，MSLN)，是一種分子量為40kDa細(xì)胞表面糖蛋白，在胰腺惡性腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)，在正常胰腺組織、急慢性胰腺炎癥及良性病變中不表達(dá)，是胰腺癌的新型標(biāo)志物。超順磁性氧化鐵(SPIO)納米微粒作為MRI陰性對(duì)比劑，具有毒性小，生物相容性

3、高等優(yōu)點(diǎn)。本課題先在超順磁性氧化鐵SPIO(Fe3O4)微粒表面包裹一層無(wú)定形的SiO2組織，然后在其表面連接MSLN抗體，制備出新型的MRI陰性靶向磁性對(duì)比劑，分析該對(duì)比劑的表征、毒性作用，以及研究其與胰腺癌組織及細(xì)胞的體內(nèi)外靶向結(jié)合能力。
　　目的：
　　合成MSLN抗體修飾的Fe3O4@SiO2新型靶向性磁性納米探針(A-MFS)，作為MRI陰性對(duì)比劑。觀察納米探針的表征及毒性作用，并根據(jù)該納米探針對(duì)體外胰腺癌細(xì)胞及裸

4、鼠皮下胰腺癌移植瘤的靶向?qū)嶒?yàn)，分析其作為診斷胰腺癌的陰性MRI對(duì)比劑的可行性。
　　方法：
　　一、靶向性磁性納米探針(A-MFS)的制備
　　根據(jù)溶劑熱法合成Fe3O4納米顆粒，然后將氨基硅烷(SiO2-NH2)包裹在Fe3O4顆粒表面，制成Fe3O4@SiO2-NH2納米材料(FS)，最后在FS表面修飾連接MSLN抗體，合成靶向性磁性納米探針(A-MFS)，觀察該納米探針的形態(tài)特征、分散穩(wěn)定性、測(cè)量材料的流體動(dòng)力直

5、徑及弛豫率。
　　二、靶向性磁性納米探針A-MFS的毒性實(shí)驗(yàn)
　　將不同濃度的A-MFS納米探針?lè)謩e與SW1990細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間，采用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的活性率;對(duì)裸鼠的多個(gè)器官進(jìn)行HE染色，觀察注射納米探針后器官的病理改變。
　　三、靶向性磁性納米探針A-MFS的體外靶向?qū)嶒?yàn)
　　將水溶性紅色熒光量子點(diǎn)加到FS和A-MFS納米探針上，制備熒光納米探針，取處于對(duì)數(shù)期人胰腺癌細(xì)胞株SW1990分別與熒光

6、納米探針FS和A-MFS共同孵育30min，人肝癌細(xì)胞株LM-3作為對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察熒光納米探針與細(xì)胞的吸附作用。胰酶消化SW1990及LM-3細(xì)胞后，分別與FS及A-MFS納米探針共同孵育1h，然后上樣進(jìn)行流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)納米探針與細(xì)胞的吸附率，從而定量觀察納米探針對(duì)胰腺癌細(xì)胞的體外靶向能力。
　　四、靶向性磁性納米探針A-MFS的體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)（MRI實(shí)驗(yàn)）
　　取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1990細(xì)胞懸液(2×107/m

7、L)0.1mL注射在裸鼠右側(cè)腋窩皮下，注射成功后的裸鼠繼續(xù)放置于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)孵育，定期觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。從建模成功的裸鼠中，選取精神狀態(tài)良好、移植瘤大小合適者，隨機(jī)分三組，麻醉后在西門(mén)子3.0T磁共振儀下進(jìn)行成像，各組裸鼠經(jīng)尾靜脈分別注射生理鹽水、FS及A-MFS納米探針，對(duì)比注射不同溶液前后裸鼠移植瘤T2WI圖像，測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)移植瘤的T2WI信號(hào)強(qiáng)度。根據(jù)Fe在腫瘤及主要器官內(nèi)分布，定量分析納米探針對(duì)移植瘤的靶向作用。并且

8、進(jìn)一步通過(guò)電鏡直接觀察腫瘤組織內(nèi)是否含有納米探針來(lái)驗(yàn)證探針的靶向性。
　　結(jié)果：
　　一、靶向性磁性納米探針A-MFS的表征
　　A-MFS納米探針成功制備，該探針大小均勻一致，流體動(dòng)力直徑集中在110-130nm，外觀呈球形。中心黑色的部分為電子密度較高的磁核，周?chē)疑牟糠譃镾iO2包裹層。XPS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Si和MSLN抗體成功連接到材料表面。A-MFS納米探針的分散穩(wěn)定性良好。A-MFS納米探針的橫向弛豫率(r

9、2)為59.435mM/s，縱向弛豫率（r1）為0.549 mM/s，r2/r1比值高，說(shuō)明該納米探針可以作為MRI陰性對(duì)比劑，且陰性對(duì)比效果好。
　　一、靶向性磁性納米探針A-MFS的毒性
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的A-MFS納米探針與SW1990孵育不同時(shí)間后，細(xì)胞活性始終高于85％。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A-MFS在裸鼠體內(nèi)循環(huán)時(shí)間僅數(shù)小時(shí)，因此，A-MFS納米探針基本無(wú)毒性。而且注射A-MFS后裸鼠多個(gè)器官的HE

10、染色結(jié)果，與注射生理鹽水對(duì)比無(wú)差異。CCK-8實(shí)驗(yàn)及HE染色結(jié)果均表明A-MFS納米探針的安全性高，可用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究。
　　三、靶向性磁性納米探針A-MFS的體外靶向?qū)嶒?yàn)
　　A-MFS納米探針與SW1990共同孵育后，可在細(xì)胞表面觀察到較強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度高于FS與SW1990、A-MFS與LM-3共同孵育后的熒光信號(hào)。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A-MFS與SW1990細(xì)胞的結(jié)合率最高。
　　四、靶向性磁性納米

11、探針A-MFS的體內(nèi)MRI靶向?qū)嶒?yàn)
　　裸鼠體內(nèi)MRI圖像顯示，經(jīng)裸鼠尾靜脈注射A-MFS后，移植瘤的信號(hào)逐漸減低，約2.5h時(shí)降到最低。而注射FS和生理鹽水，移植瘤的信號(hào)無(wú)明顯減低。測(cè)量裸鼠移植瘤T2WI信號(hào)值顯示，注射A-MFS納米探針2.5h時(shí)裸鼠移植瘤的T2信號(hào)強(qiáng)度降低了約342.533±42.6，而注射生理鹽水及FS后移植瘤的T2信號(hào)強(qiáng)度分別降低了-61.233±33.9、-58.7±19.4，結(jié)果表明A-MFS組移植瘤

12、的信號(hào)明顯減低，與生理鹽水組及FS組差異顯著(P＜0.05)。裸鼠移植瘤及主要器官內(nèi)Fe分布結(jié)果顯示，注射A-MFS納米探針后腫瘤及肺組織（胸膜表達(dá)MSLN）內(nèi)Fe含量明顯高于注射FS材料組，其他器官（心、肝、脾、腎）Fe含量與注射FS材料組相仿。且A-MFS組的腫瘤組織在電鏡下可觀察到黑色的納米顆粒。
　　結(jié)論：
　　本研究將MSLN抗體連接到Fe3O4@SiO2納米材料表面，成功制備出靶向性磁性納米探針A-MFS。電鏡下