MUC1-VNTR核酸疫苗抗胰腺癌的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、胰腺癌是各種惡性腫瘤中惡性程度極高的腫瘤之一，其病因至今不完全明確。目前胰腺癌的治療仍以手術(shù)為主，但是手術(shù)只能切除肉眼可見的病灶，對轉(zhuǎn)移和微小的病灶無法去除，而這些轉(zhuǎn)移和微小病灶正是造成胰腺癌復(fù)發(fā)和患者死亡的主要因素。因此尋找對胰腺癌有效治療手段，是目前國際上的研究熱點之一。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究MUC1-VNTR核酸疫苗抗胰腺癌的體內(nèi)外效應(yīng)。實驗分為兩個部分： 第—部分 MUC1-VNTR 核酸疫苗抗胰腺癌的體內(nèi)實

2、驗研究第—節(jié)小鼠胰腺癌細(xì)胞系 panc02-MUC1 構(gòu)建研究 目的： 構(gòu)建表達(dá)MUC1的小鼠胰腺癌細(xì)胞系panc02-MUC1。 材料和方法： 小鼠胰腺癌細(xì)胞系panc02由美國 MD Anderson Cancer center贈送，表達(dá)全長MUC1的質(zhì)粒pcDNA3-MUC1由美國匹茲堡大學(xué) Dr.Finn 贈送。體外以Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3-MUC1質(zhì)粒到小鼠胰腺

3、癌細(xì)胞系panc02中，并以空載質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照；轉(zhuǎn)染細(xì)胞再經(jīng)G418壓力篩選單克隆細(xì)胞株；并于小鼠皮下接種進(jìn)行成瘤實驗。 結(jié)果： 構(gòu)建單克隆細(xì)胞株panc02-MUC1經(jīng)Western blot檢測可見MUC1蛋白表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光檢測可見細(xì)胞膜上有MUC1表達(dá)；且動物接種實驗證實該細(xì)胞可在正常小鼠皮下成瘤，免疫組化檢測可見該細(xì)胞系在 C57BL/6 小鼠皮下接種胰腺癌模型中可表達(dá)MUC1。 結(jié)論

4、： 構(gòu)建的細(xì)胞系為可表達(dá)MUC1的單克隆細(xì)胞系，且該細(xì)胞系可在正常C57BL/6小鼠中成瘤。 第二節(jié) MUC1-VNTR 核酸疫苗預(yù)防小鼠胰腺癌實驗研究研究 目的： 以pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒肌注免疫C57BL/6小鼠，以pcDNA3.1空載質(zhì)粒及PBS免疫小鼠為對照；研究MUC1-VNTR核酸疫苗免疫小鼠能否預(yù)防表達(dá)MUC1的小鼠胰腺癌細(xì)胞panc02-MUC1的成瘤效應(yīng)。 材料和方法：

5、 C57BL/6正常小鼠，隨機分3組，每組18只：分別為PBS組、Neo組(pcDNA3.1免疫組)、MUC1組(pcDNA3.1-VNTR免疫組)。各組小鼠經(jīng)右腿脛前肌中部注射100μg/100μl質(zhì)粒PBS溶液。第 1 次免疫2周后，以同一質(zhì)粒再次免疫小鼠，第2次免疫2周后，以同一質(zhì)粒再次免疫小鼠；第3次免疫結(jié)束后5日自內(nèi)眥靜脈采血獲得血清并以ELISA法測抗VNTR抗體；取脾細(xì)胞懸液體外以VNTR合成肽特異性刺激培養(yǎng)(每組3

6、只)，3天后以LDH法進(jìn)行CTL殺傷試驗；第3次免疫結(jié)束后7日，各組小鼠經(jīng)左側(cè)前肢腋下皮下注射1×10<'6>/100μl/只panc02-MUC1細(xì)胞，7日后接種部位皮下可及腫塊，每2-3日測量腫瘤長徑及短徑，觀察MUC1-VNTR 核酸疫苗預(yù)防小鼠胰腺癌細(xì)胞panc02-MUC1的成瘤效應(yīng)。另6只pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒免疫小鼠接種 panc02-Neo 細(xì)胞，接種細(xì)胞量為1×10<'6>/100μl/只。腫瘤體積大于100

7、0mm<'3>時，視該小鼠死亡。 第三節(jié) GMCSF聯(lián)合MUC1-VNTR 核酸疫苗治療小鼠胰腺癌實驗研究研究 目的： 以GMCSF聯(lián)合pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒治療荷載panc02-MUC1的C57BL/6小鼠。 材料和方法： 0天C57BL/6正常小鼠經(jīng)左側(cè)前肢腋下皮下注射panc02-MUC1細(xì)胞1×10<'6>/100μL／只，隨機分5組，：G+M(GMCSF+MUC1)(n=10)、

8、M(MUC1)(n=10)、G(GMCSF)(n=10)、Neo(pcDNA3.1)(n=9)及PBS(n=9)組。4天時各組分別經(jīng)后腿肌肉注射 GMCSF50ng/100μl+pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒 100μg/100μl、pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒 100μg/100μl、GMCSF50ng/100μl、pcDNA3.1 質(zhì)粒100μg/100μl、PBS100μl；于9天、14天各重復(fù)注射一次。腫瘤接種后6-7天開

9、始測量各組小鼠腫瘤長徑及短徑，小鼠腫瘤體積超過1000mm<'3>視為小鼠死亡；第3次治療后11天各組取3只小鼠脾細(xì)胞體外行殺傷實驗。另12只小鼠分為G+M(GMCSF+MUC1)、M(MUC1)兩組，每組6只，0天時經(jīng)左側(cè)前肢腋下皮下注射 1×10<'6>/100μl只panc02-Neo細(xì)胞，4天時各組分別經(jīng)后腿肌肉注射GMCSF50ng/100μl+pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒 100μg/100μl、pcDNA3.1-VNT

10、R質(zhì)粒100μg/100μl；于9天、14天各重復(fù)注射一次。腫瘤接種后6-7天開始測量各組小鼠腫瘤長徑及短徑，小鼠腫瘤體積超過1000mm<'3>視為小鼠死亡。 結(jié)論： GMCSF 聯(lián)合 MUC1 核酸疫苗或單用 MUC1 核酸疫苗可以抑制荷載panc02-MUC1 腫瘤小鼠腫瘤的生長；且聯(lián)合GMCSF具有更強的抑制作用，但聯(lián)合GMCSF對荷瘤小鼠生存期無明顯影響。 第二部分 MCU1-VMTR 核酸疫苗抗胰腺癌

11、的體外實驗研究第一節(jié)人外周血樹突細(xì)胞體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究研究 目的： 從健康人外周血分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，體外經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突細(xì)胞，體外進(jìn)行生物學(xué)特性研究。 材料和方法： 體外以淋巴細(xì)胞分離液Ficoll經(jīng)健康人外周血白細(xì)胞懸液分離PBMC，體外以 GMCSF、IL4 誘導(dǎo)樹突細(xì)胞，并以TNFα促細(xì)胞成熟。FACS法(流式細(xì)胞儀)分析PBMC及成熟樹突細(xì)胞表型；混和淋巴細(xì)胞反應(yīng)(ML

12、R)分析成熟樹突細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力。 結(jié)果： 以GMCSF、IL4 及 TNFα細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，體外可以從外周血細(xì)胞擴增獲得成熟樹突細(xì)胞；成熟樹突細(xì)胞其細(xì)胞表面標(biāo)志物HLA-DR、CD209、CD86明顯升高(P<0.05)；而淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物CD3/CD8/CD4及單核細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14明顯降低(P<0.05)。混和淋巴細(xì)胞反應(yīng)表明成熟樹突細(xì)胞較未成熟樹突細(xì)胞有更高的刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖

13、能力(P<0.05)。 結(jié)論： 體外聯(lián)合 GMCSF、IL4 及 TNFα細(xì)胞因子可以從外周血擴增樹突細(xì)胞，且獲得的成熟樹突細(xì)胞與未成熟樹突細(xì)胞相比具有更強的抗原遞呈功能(P<0.05)。 第二節(jié)轉(zhuǎn)染MUC1-VNTR核酸疫苗樹突細(xì)胞功能的體外研究研究 目的： 以 pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染健康人樹突細(xì)胞，研究其在人樹突細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；以及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒的樹突細(xì)

14、胞是否可以刺激自體 T細(xì)胞增殖；并以Elispot法檢測分泌IFNγ及GranzymeB的CTL細(xì)胞。 材料和方法： 體外從健康人外周血PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)第5天，以Lipofectamine2000體外轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒，并以TNFα促細(xì)胞成熟。Western blot法檢測MUC1-VNTR多肽的表達(dá)；pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成熟樹突細(xì)胞與自體T細(xì)胞混和培養(yǎng)，刺激T細(xì)胞增殖

15、，以<'3>H測定刺激增殖能力；以Elispot法檢測pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成熟樹突細(xì)胞刺激自體T細(xì)胞獲得分泌IFNγ及GranzymeB的CTL細(xì)胞數(shù)。 結(jié)論： pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)?？梢栽谌梭w樹突細(xì)胞中表達(dá)MUC1-VNTR多肽；且轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒的成熟樹突細(xì)胞可以刺激自體初始T細(xì)胞增殖；刺激分泌IFNγ及GranzymeB的CTL細(xì)胞增殖。 第三節(jié)轉(zhuǎn)染 MUC1-V

16、NTR 核酸疫苗樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的特異性CTL對表達(dá)MUC1胰腺癌細(xì)胞的體外殺傷實驗研究 目的： pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞，并促成熟后，與自體T細(xì)胞體外共培養(yǎng)獲得MUC1特異性的CTL，體外研究其對表達(dá)MUC1胰腺癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)。材料和方法： 從HLA-A<,2>+健康人外周血PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突細(xì)胞，培養(yǎng)至第5日，以Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒，并以空

17、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染樹突細(xì)胞及Lipofectamine2000 處理樹突細(xì)胞為對照；促成熟后樹突細(xì)胞與自體 T 細(xì)胞共刺激培養(yǎng)獲得CTL，體外以LDH法檢測該CTL對HLA-A<,2>+MUC1+胰腺癌細(xì)胞Capan-2的殺傷效應(yīng)。 結(jié)果： 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒的成熟樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL可以特異性地殺傷HLA-A<,2>+MUC1+胰腺癌細(xì)胞 Capan-2，該殺傷效應(yīng)可以被MUC1單克隆抗體VU3C6 所抑制；且該