MUC1-VNTR核酸疫苗抗胰腺癌的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、胰腺癌是各種惡性腫瘤中惡性程度極高的腫瘤之一，其病因至今不完全明確。目前胰腺癌的治療仍以手術(shù)為主，但是手術(shù)只能切除肉眼可見的病灶，對轉(zhuǎn)移和微小的病灶無法去除，而這些轉(zhuǎn)移和微小病灶正是造成胰腺癌復(fù)發(fā)和患者死亡的主要因素。因此尋找對胰腺癌有效治療手段，是目前國際上的研究熱點之一。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步研究MUC1-VNTR核酸疫苗抗胰腺癌的體內(nèi)外效應(yīng)。實驗分為兩個部分： 第—部分 MUC1-VNTR 核酸疫苗抗胰腺癌的體內(nèi)實

2、驗研究第—節(jié)小鼠胰腺癌細胞系 panc02-MUC1 構(gòu)建研究 目的： 構(gòu)建表達MUC1的小鼠胰腺癌細胞系panc02-MUC1。 材料和方法： 小鼠胰腺癌細胞系panc02由美國 MD Anderson Cancer center贈送，表達全長MUC1的質(zhì)粒pcDNA3-MUC1由美國匹茲堡大學(xué) Dr.Finn 贈送。體外以Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3-MUC1質(zhì)粒到小鼠胰腺

3、癌細胞系panc02中，并以空載質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染細胞為對照；轉(zhuǎn)染細胞再經(jīng)G418壓力篩選單克隆細胞株；并于小鼠皮下接種進行成瘤實驗。 結(jié)果： 構(gòu)建單克隆細胞株panc02-MUC1經(jīng)Western blot檢測可見MUC1蛋白表達；細胞免疫熒光檢測可見細胞膜上有MUC1表達；且動物接種實驗證實該細胞可在正常小鼠皮下成瘤，免疫組化檢測可見該細胞系在 C57BL/6 小鼠皮下接種胰腺癌模型中可表達MUC1。 結(jié)論

4、： 構(gòu)建的細胞系為可表達MUC1的單克隆細胞系，且該細胞系可在正常C57BL/6小鼠中成瘤。 第二節(jié) MUC1-VNTR 核酸疫苗預(yù)防小鼠胰腺癌實驗研究研究 目的： 以pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒肌注免疫C57BL/6小鼠，以pcDNA3.1空載質(zhì)粒及PBS免疫小鼠為對照；研究MUC1-VNTR核酸疫苗免疫小鼠能否預(yù)防表達MUC1的小鼠胰腺癌細胞panc02-MUC1的成瘤效應(yīng)。 材料和方法：

5、 C57BL/6正常小鼠，隨機分3組，每組18只：分別為PBS組、Neo組(pcDNA3.1免疫組)、MUC1組(pcDNA3.1-VNTR免疫組)。各組小鼠經(jīng)右腿脛前肌中部注射100μg/100μl質(zhì)粒PBS溶液。第 1 次免疫2周后，以同一質(zhì)粒再次免疫小鼠，第2次免疫2周后，以同一質(zhì)粒再次免疫小鼠；第3次免疫結(jié)束后5日自內(nèi)眥靜脈采血獲得血清并以ELISA法測抗VNTR抗體；取脾細胞懸液體外以VNTR合成肽特異性刺激培養(yǎng)(每組3

6、只)，3天后以LDH法進行CTL殺傷試驗；第3次免疫結(jié)束后7日，各組小鼠經(jīng)左側(cè)前肢腋下皮下注射1×10<'6>/100μl/只panc02-MUC1細胞，7日后接種部位皮下可及腫塊，每2-3日測量腫瘤長徑及短徑，觀察MUC1-VNTR 核酸疫苗預(yù)防小鼠胰腺癌細胞panc02-MUC1的成瘤效應(yīng)。另6只pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒免疫小鼠接種 panc02-Neo 細胞，接種細胞量為1×10<'6>/100μl/只。腫瘤體積大于100

7、0mm<'3>時，視該小鼠死亡。 第三節(jié) GMCSF聯(lián)合MUC1-VNTR 核酸疫苗治療小鼠胰腺癌實驗研究研究 目的： 以GMCSF聯(lián)合pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒治療荷載panc02-MUC1的C57BL/6小鼠。 材料和方法： 0天C57BL/6正常小鼠經(jīng)左側(cè)前肢腋下皮下注射panc02-MUC1細胞1×10<'6>/100μL／只，隨機分5組，：G+M(GMCSF+MUC1)(n=10)、

8、M(MUC1)(n=10)、G(GMCSF)(n=10)、Neo(pcDNA3.1)(n=9)及PBS(n=9)組。4天時各組分別經(jīng)后腿肌肉注射 GMCSF50ng/100μl+pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒 100μg/100μl、pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒 100μg/100μl、GMCSF50ng/100μl、pcDNA3.1 質(zhì)粒100μg/100μl、PBS100μl；于9天、14天各重復(fù)注射一次。腫瘤接種后6-7天開

9、始測量各組小鼠腫瘤長徑及短徑，小鼠腫瘤體積超過1000mm<'3>視為小鼠死亡；第3次治療后11天各組取3只小鼠脾細胞體外行殺傷實驗。另12只小鼠分為G+M(GMCSF+MUC1)、M(MUC1)兩組，每組6只，0天時經(jīng)左側(cè)前肢腋下皮下注射 1×10<'6>/100μl只panc02-Neo細胞，4天時各組分別經(jīng)后腿肌肉注射GMCSF50ng/100μl+pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒 100μg/100μl、pcDNA3.1-VNT

10、R質(zhì)粒100μg/100μl；于9天、14天各重復(fù)注射一次。腫瘤接種后6-7天開始測量各組小鼠腫瘤長徑及短徑，小鼠腫瘤體積超過1000mm<'3>視為小鼠死亡。 結(jié)論： GMCSF 聯(lián)合 MUC1 核酸疫苗或單用 MUC1 核酸疫苗可以抑制荷載panc02-MUC1 腫瘤小鼠腫瘤的生長；且聯(lián)合GMCSF具有更強的抑制作用，但聯(lián)合GMCSF對荷瘤小鼠生存期無明顯影響。 第二部分 MCU1-VMTR 核酸疫苗抗胰腺癌

11、的體外實驗研究第一節(jié)人外周血樹突細胞體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究研究 目的： 從健康人外周血分離外周血單個核細胞(PBMC)，體外經(jīng)細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突細胞，體外進行生物學(xué)特性研究。 材料和方法： 體外以淋巴細胞分離液Ficoll經(jīng)健康人外周血白細胞懸液分離PBMC，體外以 GMCSF、IL4 誘導(dǎo)樹突細胞，并以TNFα促細胞成熟。FACS法(流式細胞儀)分析PBMC及成熟樹突細胞表型；混和淋巴細胞反應(yīng)(ML

12、R)分析成熟樹突細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖能力。 結(jié)果： 以GMCSF、IL4 及 TNFα細胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，體外可以從外周血細胞擴增獲得成熟樹突細胞；成熟樹突細胞其細胞表面標(biāo)志物HLA-DR、CD209、CD86明顯升高(P<0.05)；而淋巴細胞表面標(biāo)志物CD3/CD8/CD4及單核細胞表面標(biāo)志物CD14明顯降低(P<0.05)。混和淋巴細胞反應(yīng)表明成熟樹突細胞較未成熟樹突細胞有更高的刺激同種異體T淋巴細胞增殖

13、能力(P<0.05)。 結(jié)論： 體外聯(lián)合 GMCSF、IL4 及 TNFα細胞因子可以從外周血擴增樹突細胞，且獲得的成熟樹突細胞與未成熟樹突細胞相比具有更強的抗原遞呈功能(P<0.05)。 第二節(jié)轉(zhuǎn)染MUC1-VNTR核酸疫苗樹突細胞功能的體外研究研究 目的： 以 pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染健康人樹突細胞，研究其在人樹突細胞內(nèi)的表達情況；以及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒的樹突細

14、胞是否可以刺激自體 T細胞增殖；并以Elispot法檢測分泌IFNγ及GranzymeB的CTL細胞。 材料和方法： 體外從健康人外周血PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突細胞，于細胞培養(yǎng)第5天，以Lipofectamine2000體外轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒，并以TNFα促細胞成熟。Western blot法檢測MUC1-VNTR多肽的表達；pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成熟樹突細胞與自體T細胞混和培養(yǎng)，刺激T細胞增殖

15、，以<'3>H測定刺激增殖能力；以Elispot法檢測pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成熟樹突細胞刺激自體T細胞獲得分泌IFNγ及GranzymeB的CTL細胞數(shù)。 結(jié)論： pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)?？梢栽谌梭w樹突細胞中表達MUC1-VNTR多肽；且轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒的成熟樹突細胞可以刺激自體初始T細胞增殖；刺激分泌IFNγ及GranzymeB的CTL細胞增殖。 第三節(jié)轉(zhuǎn)染 MUC1-V

16、NTR 核酸疫苗樹突細胞誘導(dǎo)的特異性CTL對表達MUC1胰腺癌細胞的體外殺傷實驗研究 目的： pcDNA3.1-VNTR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染樹突細胞，并促成熟后，與自體T細胞體外共培養(yǎng)獲得MUC1特異性的CTL，體外研究其對表達MUC1胰腺癌細胞殺傷效應(yīng)。材料和方法： 從HLA-A<,2>+健康人外周血PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)樹突細胞，培養(yǎng)至第5日，以Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒，并以空

17、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染樹突細胞及Lipofectamine2000 處理樹突細胞為對照；促成熟后樹突細胞與自體 T 細胞共刺激培養(yǎng)獲得CTL，體外以LDH法檢測該CTL對HLA-A<,2>+MUC1+胰腺癌細胞Capan-2的殺傷效應(yīng)。 結(jié)果： 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VNTR質(zhì)粒的成熟樹突細胞誘導(dǎo)的CTL可以特異性地殺傷HLA-A<,2>+MUC1+胰腺癌細胞 Capan-2，該殺傷效應(yīng)可以被MUC1單克隆抗體VU3C6 所抑制；且該