MUC1-ETR-pDC316載體介導(dǎo)的胰腺癌特異性MR分子顯像初步研究.pdf

1、研究背景：胰腺癌是現(xiàn)今惡性程度最高、預(yù)后最差的腫瘤之一，早期診斷率低下是胰腺癌死亡率極高的重要原因。目前常規(guī)的影像學(xué)及腫瘤標(biāo)志物檢查難以對胰腺癌作出有效的早期診斷。黏蛋白1(MUC1)基因的異常表達(dá)已被證實(shí)是胰腺癌等腫瘤的早期相對特異性分子生物學(xué)改變，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)介導(dǎo)的分子顯像可提供分子水平的顯像能力，將兩者的優(yōu)勢聯(lián)合構(gòu)建一種新型的顯像方法，可為胰腺癌的早期特異性診斷提供幫助。在前期研究中我們擴(kuò)增了MUC1基因啟動子中與組織特

2、異表達(dá)有關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控序列，并將不含有啟動子及3'端不穩(wěn)定序列的TfR編碼序列(ETR)置于該啟動子的控制下，以pDC316穿梭質(zhì)粒為載體構(gòu)建了MUC1-ETR/pDC316真核表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有驅(qū)動ETR基因在muc1基因陽性的胰腺癌細(xì)胞中不受鐵濃度負(fù)反饋調(diào)節(jié)，特異性表達(dá)大量TfR，并被磁性探針靶向標(biāo)記而顯像的潛力。
　　 目的：⑴驗(yàn)證MUC1-ETR/pDC316真核表達(dá)載體在muc1陽性細(xì)胞內(nèi)的特異性表達(dá)。⑵通過體外MR成

3、像探討以TfR為報告分子反映細(xì)胞內(nèi)muc1基因異常表達(dá)的可行性，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步靶向治療研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法：①EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切MUC1-ETR/pDC316質(zhì)粒，切膠回收純化獲得ETR片段，雙向測序證實(shí)序列正確；將ETR基因與EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切后的pDC316質(zhì)粒連接并測序證實(shí)插入位置、方向及序列正確。②TRIzol法提取胰腺癌細(xì)胞株Capan-2、Panc-1及乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231總RN

4、A，以文獻(xiàn)報道的muc1和β-actin基因引物對各株細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，2％瓊脂糖凝膠分離產(chǎn)物，分析muc1基因表達(dá)情況。③各株細(xì)胞分為未處理組、陰性對照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組，后三組分別以pDC316空質(zhì)粒、MUC1-ETR/pDC316質(zhì)粒及MCMV-ETR/pDC316質(zhì)粒進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72小時分別對各組取樣，提取總RNA，實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增TfR基因，觀察不同時點(diǎn)各株細(xì)胞各處理組TfR

5、 mRNA表達(dá)。④各株細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染后48小時進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，比較各株細(xì)胞各處理組細(xì)胞表面TfR平均熒光強(qiáng)度。⑤將Panc-1細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒后48小時，于培養(yǎng)基中加入人飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白(holo-Tf至終濃度800μg/mL，37℃孵育2小時后用原子吸收分光光度法測定細(xì)胞內(nèi)鐵濃度，另設(shè)未處理組和僅加Tf組為對照。⑥各株細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48小時消化細(xì)胞，計數(shù)后均取

6、106個細(xì)胞標(biāo)記抗人CD71免疫磁珠，進(jìn)行體外MR顯像，分析T2弛豫率的改變。另設(shè)未標(biāo)記細(xì)胞和明膠為對照。⑦所有計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批次。兩個獨(dú)立樣本之間的以t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，p＞0.05表示差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)分析軟件為SPSS11.0。
　　 結(jié)果：⑴雙酶切及連接反應(yīng)后對所構(gòu)建的載體進(jìn)行雙向測序鑒定證實(shí)序列及插入位置、方向正確，成功構(gòu)建MC

7、MV-ETR/pDC316陽性對照質(zhì)粒。⑵RT-PCR擴(kuò)增muc1和β-actin基因后，產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下可見Capan-2、Panc-1細(xì)胞株可擴(kuò)增出489bp的muc1條帶，MDA-MB-231細(xì)胞在該位置無條帶，各株細(xì)胞內(nèi)參基因β-actin條帶位置及亮度一致。⑶各株細(xì)胞陽性對照組在轉(zhuǎn)染后24-72小時TfR mRNA表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞均明顯上調(diào)(p＜0.01)；muc1陽性的Capan-2、Panc-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)

8、染實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒后24-72小時TfR mRNA亦較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯上調(diào)(p＜0.01)，但上調(diào)幅度低于陽性對照組；MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組后24小時TfR mRNA亦較未轉(zhuǎn)染組上調(diào)，幅度低于Capan-2、Panc-1細(xì)胞，48小時后表達(dá)量與未處理組及陰性對照組無明顯差異；各株細(xì)胞陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后TfR mRNA表達(dá)上調(diào)隨時間延長有下降的趨勢；各株細(xì)胞陰性對照組轉(zhuǎn)染前后TfR mRNA表達(dá)與未處理組無明顯差異。⑷Capan

9、-2、Panc-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和陽性對照質(zhì)粒后48小時，表面TfR平均熒光強(qiáng)度較未處理細(xì)胞明顯增強(qiáng)(p＜0.05)，提示細(xì)胞表面TfR蛋白表達(dá)增加；MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒后48小時平均熒光強(qiáng)度無增強(qiáng)。以上結(jié)果和mRNA表達(dá)變化情況基本一致，支持轉(zhuǎn)染MUC1-ETR/pDC316質(zhì)?？蛇x擇性上調(diào)muc1陽性細(xì)胞表面TfR的推測。⑸在富鐵環(huán)境下孵育2小時后，僅加holo-Tf一組以及實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組細(xì)胞內(nèi)鐵含量均較未處

10、理細(xì)胞有上升趨勢，初步證明上調(diào)的TfR具有正常的攝鐵功能，可增加細(xì)胞的鐵攝入。⑹Capan-2、Panc-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染后48小時進(jìn)行的MR成像中T2馳豫率均較未處理組有下降趨勢，；MDA-MB-231細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與未處理組在MR信號上無明顯改變；三株細(xì)胞的陽性對照組較未處理組均有明顯的T2馳豫率下降。以上MR信號差別尚難以用肉眼分辨。
　　 結(jié)論：①實(shí)驗(yàn)證實(shí)MUC1-ETR/pDC316質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可特異性表達(dá)于muc1基因陽