Plectin1熒光、MRI靶向分子探針對胰腺癌早期診斷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分Plectin1雙模態(tài)靶向分子探針的構(gòu)建及性能表征
　　目的：
　　合成氨基化磷脂聚乙二醇修飾的磁性納米粒子(NH2-PEG?SPIONs)，進(jìn)而構(gòu)建基于胰腺癌Plectin1的熒光、MRI雙模態(tài)靶向胰腺癌的分子探針（anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）。并對該磁性納米粒子和分子探針的性能進(jìn)行表征。
　　材料與方法：
　　1、氨基化磷脂聚乙二醇修飾的磁性納米粒子（NH2-PE

2、G?SPIONs）的合成：
　　1.1油溶性磁性納米粒子（SPIONs）的合成：將適量的乙酰丙酮鐵與二卞醚、油酸及油胺等溶劑混合，在氮?dú)猸h(huán)境中加熱至220℃，維持適當(dāng)時(shí)間繼續(xù)加熱至290℃，1h后降至室溫。在強(qiáng)磁場的作用下向上述所得溶液中加入乙醇重復(fù)沖洗數(shù)次，最終將SPIONs溶解于三氯甲烷（氯仿）中，室溫保存。
　　1.2 NH2-PEG?SPIONs的合成：取適量氨基化磷脂聚乙二醇（NH2-PEG）溶于氯仿溶液，再將適量

3、上述SPIONs氯仿溶液與NH2-PEG氯仿溶液混合均勻后再加入去離子水，65℃水浴條件下旋蒸13分鐘。將旋蒸后的水溶液置于高速離心機(jī)離心，繼而行探頭超聲。用濾膜將上述NH2-PEG?SPIONs的水溶液濾過若干次，4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2、雙模態(tài)靶向分子探針（anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）的構(gòu)建：將上述步驟合成的NH2-PEG?SPIONs水溶液與MES緩沖液混勻至20ml，向混合液中分別加入2

4、.68ml EDC溶液及4.8ml Sulfo-NHS溶液，放入恒溫器中振蕩混勻約30min，繼而高速離心3次，每次離心間隙均用硼酸鹽溶液清洗，終溶液配制成20ml的 NH2-PEG?SPIONs硼酸鹽溶液。向上述溶液中加入70μl0.5mg/ml的anti-Plectin1抗體及700ug Cy7-NHS，置于搖床15℃條件下100rpm過夜反應(yīng)，最終用2.2ml0.1g/ml的BSA將其封閉，置于4℃冰箱保存，過程中嚴(yán)格避光。

5、>　　3、磁性納米粒子（ NH2-PEG?SPIONs）和分子探針（ anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）的性能表征：采用透射電子顯微鏡( TEM)觀察NH2-PEG?SPIONs的形態(tài)，應(yīng)用高分辨率透射電子顯微鏡（ HRTEM）觀察NH2-PEG?SPIONs的核心粒徑；檢測磁性納米粒子（NH2-PEG?SPIONs）的膠體穩(wěn)定性；分別測量 NH2-PEG?SPIONs、NH2-PEG?SPIONs-Cy

6、7及 anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7的水動力尺寸、Zeta電位；使用振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)、磁共振成像等檢測NH2-PEG?SPIONs的磁學(xué)性質(zhì)；應(yīng)用NH2-PEG?SPIONs和分子探針進(jìn)行健康、活體小鼠體內(nèi)毒理實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　TEM及HRTEM顯示NH2-PEG?SPIONs的核心粒徑在9nm~15nm之間，平均粒徑12nm，形態(tài)均一，單分散性好；NH2-PEG?SPIONs

7、的膠體穩(wěn)定性好；振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)的磁性分析顯示DSPE-PEG?SPIONs余磁為0，為超順磁性材料，其飽和的磁化強(qiáng)度為80 emμg-1，適合作為MR成像的對比劑；體外MRI成像結(jié)果顯示，隨著納米粒子NH2-PEG?SPIONs濃度的增加，T2加權(quán)成像信號逐漸降低；體外弛豫曲線測量的r2值為115.95mM/s；依次測得NH2-PEG?SPIONs、NH2-PEG?SPIONs-Cy7及anti-Plectin1-NH2-PE

8、G?SPIONs-Cy7的水動力尺寸眾數(shù)分別在28.85nm、55.80nm及84.34nm左右，均在MRI造影劑可接受粒子大小范圍內(nèi)；測得NH2-PEG?SPIONs、NH2-PEG?SPIONs-Cy7及anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7的Zeta電位分別為15.9mV、﹣24.8mV及﹣11.3mV，在一定程度上說明熒光材料Cy7-NHS和（或）抗體anti-Plectin1成功連接到磁性納米粒子表面

9、；動物體內(nèi)毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該磁性納米粒子和分子探針對活體重要臟器無毒性作用。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)研制出的雙模態(tài)靶向分子探針（anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）的粒徑小、磁學(xué)參數(shù)理想且無明顯毒理作用，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示磁性納米粒子在MRI T2WI上為低信號，提示該分子探針可能是一個理想的MRI分子探針。
　　第二部分雙模態(tài)靶向分子探針應(yīng)用于人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型的活體熒光、MR成像

10、研究
　　目的：
　　應(yīng)用雙模態(tài)靶向分子探針進(jìn)行人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型的熒光、MR成像，結(jié)合熒光、MR圖像和病理結(jié)果，分析該雙模態(tài)靶向分子探針對胰腺癌的靶向成像效果。
　　材料與方法：
　　1、人胰腺癌裸鼠原位移植瘤的建立：
　　1.1胰腺癌皮下移植瘤的建立：將紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）轉(zhuǎn)染的人胰腺癌細(xì)胞株（XPA-1-RFP）在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，到細(xì)胞生長良好時(shí)

11、，經(jīng)處理、將細(xì)胞懸液分別注射于3只裸鼠的腹部皮下。通過動物熒光成像儀實(shí)時(shí)觀察皮下腫瘤的生長情況。當(dāng)皮下腫瘤生長到直徑約8mm-10mm時(shí)，將腫瘤解剖、取出分割成1mm×1mm的組織塊，浸于細(xì)胞培養(yǎng)基中備用。
　　1.2人胰腺癌裸鼠原位移植瘤的建立：肌肉注射麻醉裸鼠，采用顯微外科手術(shù)的方法，在正常裸鼠左下腹部相當(dāng)于脾臟水平做一長度約1cm的縱形切口，剪開皮膚和腹膜，暴露胰腺，正常情況下，胰腺和脾臟緊密相連。用外科手術(shù)縫線將一塊1mm

12、×1mm大小的腫瘤組織塊縫到胰腺組織上，關(guān)閉腹腔及皮膚，最后酒精消毒，置入飼養(yǎng)籠中繼續(xù)培養(yǎng)。所有手術(shù)過程均在超凈臺內(nèi)完成。于動物熒光成像儀下動態(tài)觀察腫瘤生長情況，待腫瘤生長至1cm左右時(shí)進(jìn)行 MR、熒光分子成像實(shí)驗(yàn)。
　　2、應(yīng)用靶向分子探針進(jìn)行人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型的活體MR、熒光成像：將24只荷瘤裸鼠隨機(jī)分成二組：靶向（探針）組12只，非靶向（對照）組12只。先將所有荷瘤鼠均進(jìn)行 MR平掃，再向靶向組、非靶向組的荷瘤裸鼠尾

13、靜脈分別注入200μl的0.5mg/ml靶向分子探針（ anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7）和200μl的0.5mg/ml非靶向的熒光磁性納米粒子（NH2-PEG?SPIONs-Cy7）。分別于注射后8h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)選取4只先后進(jìn)行MR掃描和近紅外熒光成像。
　　3、成像掃描結(jié)束后均處死，取小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、腫瘤進(jìn)行 HE染色、普魯士藍(lán)染色等病理檢測。
　　4、對

14、比各組、各時(shí)間點(diǎn)熒光、MRI圖像和病理檢測結(jié)果，評價(jià)本實(shí)驗(yàn)制備的雙模態(tài)靶向分子探針對對胰腺癌靶向成像效果。
　　結(jié)果：
　　注射探針8h、24h后普魯士藍(lán)染色顯示腫瘤組織、尤其是周邊部位有少量藍(lán)染鐵顆粒分布，MR T2WI上腫瘤組織信號未見明顯變化；注射探針48h后腫瘤組織在T2WI上信號表現(xiàn)出不同程度的降低，此時(shí)普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示腫瘤內(nèi)布滿大量藍(lán)染鐵顆粒，說明靶向探針能夠特異性靶向到達(dá)腫瘤組織；而非靶向探針組普魯士藍(lán)染色

15、結(jié)果顯示腫瘤內(nèi)未見明顯藍(lán)染鐵顆粒。注射探針后8h、24h的近紅外熒光成像圖顯示探針熒光主要分布于裸鼠的肝、脾區(qū)域，至48h時(shí)的近紅外熒光成像圖顯示探針熒光大部分分布于腫瘤區(qū)域、可與腫瘤熒光相重疊。裸鼠的肝臟、脾臟在注射探針后T2WI信號明顯降低，至48h時(shí)仍呈較低信號，各時(shí)間點(diǎn)的肝、脾普魯士藍(lán)染色亦顯示均含不等量藍(lán)染鐵顆粒。腎臟在注射探針前后各時(shí)間點(diǎn)T2WI上信號無明顯變化，各時(shí)間點(diǎn)普魯士藍(lán)染色顯示僅含少許或無明顯藍(lán)色鐵顆粒。
　

16、　結(jié)論：
　　該熒光、MR雙模態(tài)靶向分子探針能有效的靶向分布到裸鼠的人胰腺癌原位移植腫瘤中，引起瘤體MR T2信號不同程度的降低，其熒光成像和普魯士藍(lán)染色結(jié)果也證實(shí)該分子探針能分布在胰腺癌組織中，表明 anti-Plectin1-NH2-PEG?SPIONs-Cy7是一個理想的胰腺癌雙模態(tài)靶向分子探針，具有良好的應(yīng)用前景。但是MRI T2WI上信號變化強(qiáng)度較弱且易受腫瘤壞死、出血、囊變等因素的影響，應(yīng)用于臨床仍需要進(jìn)一步大量的研究