p16ink4a缺失小鼠縫線誘導(dǎo)角膜新生血管的特征及其機制研究.pdf

1、目的：觀察并比較正常C57BL/6小鼠與p16ink4a缺失小鼠縫線法誘導(dǎo)角膜新生血管的生長規(guī)律及異同點，對比兩者中VEGF通路相關(guān)因子和PEDF在角膜新生血管生長過程中的表達量的變化及其與角膜新生血管的關(guān)系，探討P16基因在角膜新生血管穩(wěn)態(tài)維持中的作用及機制。
　　方法：1、采用縫線法建立小鼠角膜新生血管模型。選取正常 C57BL/6小鼠作為對照組、p16ink4a缺失小鼠作為實驗組。小鼠麻醉方式為腹腔注射氯胺酮和氯丙嗪全身麻醉

2、，用角膜環(huán)鉆輕壓小鼠角膜中央，形成直徑2mm的角膜壓痕以定位縫線，11-0尼龍線垂直壓痕放射狀做3針縫線，要求穿過角膜基質(zhì)但不穿透。2、使用裂隙燈觀察動物模型，分析比較兩組間角膜新生血管的生長情況。從建模到縫線術(shù)后14天，每天通過裂隙燈觀察各組小鼠角膜新生血管的生長情況并照大體相存檔。3、免疫熒光法檢測兩組小鼠角膜 VEGF通路相關(guān)因子和PEDF的表達?？p線術(shù)后5天的眼球冰凍切片，應(yīng)用 VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、V

3、EGF-A與CD31進行雙重免疫熒光染色，觀察對比兩組角膜血管的生長情況，以及 VEGF通路相關(guān)因子、PEDF的表達部位和表達量的變化。4、分子生物學(xué)檢測兩組小鼠角膜VEGF通路相關(guān)因子和PEDF的表達?？p線術(shù)后5天提取角膜mRNA和蛋白，分別用RT-PCR方法和western blot方法檢測對比兩組小鼠角膜組織中VEGF、PEDF的表達情況。
　　結(jié)果：1.小鼠角膜新生血管的形成生長情況。對照組小鼠角膜縫線術(shù)后第一天可見角膜緣

4、處血管環(huán)充盈擴張，角膜縫線位置輕度水腫混濁。第二天從血管環(huán)長出新生血管連接成袢狀向角膜方向入侵。第三天新生血管袢到達角膜緣處，但尚未侵入角膜透明區(qū)。第四天新生血管袢長入角膜透明區(qū)。第五天開始以之前的血管袢為基底伸出新生血管，樹枝狀伸入角膜中央。第六天新生血管繼續(xù)生長，接近縫線邊緣。第七天拆除縫線，新生血管開始逐漸消退。到第十四天可見到角膜基質(zhì)內(nèi)萎縮的血管。而 p16ink4a缺失組小鼠從第一天起血管充盈及角膜水腫情況皆重于正常小鼠。第三

5、天起便有部分新生血管垂直于角膜緣伸入透明角膜。到第四天全周新生血管已樹枝狀侵入角膜基質(zhì)。第五天便到達或稍超過縫線位置，且新生血管的密度及長度明顯大于對照組小鼠。2、免疫熒光結(jié)果?？p線術(shù)后第五天角膜血管生長旺盛，免疫熒光結(jié)果對照組可見角膜緣基質(zhì)內(nèi)的 CD31染色陽性的血管，而實驗組p16ink4a缺失小鼠角膜可見明顯水腫增厚，角膜基質(zhì)全層有大量 CD31陽性血管，血管的密度增加。VEGFA和VEGF-R2可見在正常角膜基質(zhì)中有表達，而在實

6、驗組p16ink4a缺失小鼠角膜基質(zhì)中大量表達。VEGF-R1和 VEGF-R3在角膜上皮及基質(zhì)中表達，與對照組相比，VEGF-R1在實驗組大量表達，而VEGF-R3在兩組中的表達無明顯差異。PEDF表達于角膜基質(zhì)中，可見實驗組表達明顯低于正常組。3、分子生物學(xué)結(jié)果。RT-PCR檢測了兩組小鼠未縫角膜和縫線術(shù)后第5天VEGF-R1、VEGF-R2、VEGF-R3、VEGF-A和PEDF的表達水平。兩組小鼠比較VEGF-A mRNA在術(shù)前

7、表達水平無顯著差異，術(shù)后5天表達升高，且實驗組的升高明顯大于對照組（P<0.01）。 VEGF-R1 mRNA在術(shù)前表達水平無顯著差異，術(shù)后實驗組顯著上升（P<0.01）。VEGF-R2 mRNA在術(shù)前對照組表達水平顯著高于實驗組，術(shù)后兩組表達增高，且實驗組反超并顯著高于對照組（P<0.01）。VEGF-R3 mRNA在術(shù)后表達水平顯著升高，但兩組間無顯著性差異。PEDF mRNA在術(shù)后表達水平顯著下降，實驗組更低，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意

8、義（P<0.01）。Western blot結(jié)果顯示，縫線術(shù)后5天實驗組小鼠角膜組織中的VEGF和VEGF-R1蛋白表達高于對照組，而PEDF蛋白的表達明顯低于對照組。
　　結(jié)論：p16ink4a缺失小鼠在縫線誘導(dǎo)后產(chǎn)生的角膜新生血管的速度、密度及長度大于正常小鼠?？p線5天時p16ink4a缺失小鼠組，VEGF表達高，PEDF表達低，VEGF/PEDF的比值顯著高于正常小鼠模型組，另外得到R1、R2的表達水平的升高也顯著性大于對照