慢病毒介導(dǎo)p16ink4a基因沉默對老齡脂肪間充質(zhì)干細胞增殖分化能力的影響.pdf

1、研究背景:
　　阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是威脅老年人生活質(zhì)量與晚年生活的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變之一，其發(fā)病機制不明，目前尚無有效的治療方法。干細胞移植是阿爾茨海默病治療方法之一，而脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)由于其來源廣泛、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢被國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。但由于阿爾茨海默病通常高發(fā)于老年人中，所以自體干細胞將面臨由于生

2、理性衰老而導(dǎo)致的功能衰退，治療效果減低的問題。p16ink4a基因作為一種抑癌基因，在衰老干細胞中過度表達，并且在體外培養(yǎng)的衰老ADSCs中也表達上調(diào)。因此，利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)可望阻斷衰老ADSCs中的p16ink4a基因，緩解干細胞功能衰退，從而提高其治療阿爾茨海默病的治療效果。
　　目的:
　　利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)阻斷老齡ADSCs中p16ink4a基因表

3、達，觀察p16ink4a基因沉默后，老齡ADSCs增殖能力、衰老情況以及向神經(jīng)細胞定向分化能力的變化。
　　方法:
　　取SD大鼠的腹股溝和腹膜后脂肪，分離體外培養(yǎng)青年大鼠及老年大鼠ADSCs，流式細胞術(shù)鑒定表面分子標志物。將ADSCs分為以下四組:經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的老齡ADSCs(老齡ADSCs+慢病毒9934-1)，經(jīng)陰性對照病毒轉(zhuǎn)染的老齡ADSCs（老齡ADSCs+陰性對照病毒CONO49），未經(jīng)任何處理的老齡ADSCs（

4、老齡ADSCs），加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)的老齡ADSCs(老齡ADSCs+PBS)。Westernblot、realtime PCR測定四組ADSCs中p16ink4a基因的表達差異。然后以青年ADSCs組作為對照，MTT比色法描繪生長曲線探查五組ADSCs增殖能力差別。對五組細胞進行衰老染色以觀察干細胞衰老情況。過兩步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)ADSC向神經(jīng)細胞方向分化，免疫熒光法檢測分化后細胞Nestin的表達情況，比較五組細胞分化能力的區(qū)別

5、。
　　結(jié)果:
　　1.從大鼠的脂肪組織中可成功提取老齡及青年ADSCs，并穩(wěn)定增殖傳代。提取的ADSCs強烈表達CD29、CD90，低表達CD11b。
　　2.與其他三組老齡ADSCs相比，老齡ADSCs+慢病毒9934-1組中p16ink4a基因表達明顯降低(P＜0.05)。而老齡ADSCs+陰性對照病毒CONO49組，老齡ADSCs組及老齡ADSCs+PBS組之間p16ink4a基因表達無顯著性差異。
　　

6、3.與其他三組老齡ADSCs相比，老齡ADSCs+慢病毒9934-1組生長能力及誘導(dǎo)分化后細胞Nestin的表達情況明顯提高(P＜0.05)，但低于青年ADSCs組(P＜0.05)。而老齡ADSCs+陰性對照病毒CONO49組，老齡ADSCs組及老齡ADSCs+PBS組之間生長能力及誘導(dǎo)分化后細胞Nestin的表達情況無顯著性差異。
　　4.與其他三組老齡ADSCs相比，老齡ADSCs+慢病毒9934-1組衰老細胞比例明顯降低(P