免疫調(diào)節(jié)藥物(E2以及DMF)在小鼠EAE模型中的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、[背景]
　　多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘性疾病，其癥狀復(fù)雜，多呈反復(fù)發(fā)作、進(jìn)行性加重、高致殘率等特點(diǎn)。目前尚無(wú)公認(rèn)有效的可以阻止復(fù)發(fā)進(jìn)展的治療藥物。雌激素與富馬酸二甲酯作為治療MS的臨床前期藥物其作用機(jī)制尚不清楚，本研究選擇雌激素與富馬酸二甲酯兩種治療藥物，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型進(jìn)行治療，探討其藥物療效及作用機(jī)制。
　　[目的]
　　檢測(cè)雌激

2、素和富馬酸二甲酯在小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis，EAE)中的預(yù)防性治療作用并初步探討其體內(nèi)主要靶向T和/或B淋巴細(xì)胞的作用機(jī)制;另外，體外分離純化小鼠B細(xì)胞，分別利用雌激素和富馬酸單甲酯（monomethyl fumarate，MMF）進(jìn)行處理，探討這兩種藥物對(duì)B細(xì)胞的可能的調(diào)節(jié)作用。
　　[方法]
　　在無(wú)菌條件下，將髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(

3、MOG35-55)和完全弗氏佐劑(Complete Freud's Adjuvant，CFA)在室溫平衡后按1∶1的比例混合，用自制乳化器乳化至油包水狀態(tài)，經(jīng)皮下注射（200μl/每只）免疫C57BL/6J小鼠;分別在免疫2h和24h后經(jīng)腹腔注射PTX（100μl/每只）以制備EAE模型。為了探討雌激素和DMF的預(yù)防性治療作用，在免疫小鼠當(dāng)天，分別經(jīng)皮下注射雌激素和口服富馬酸二甲酯進(jìn)行預(yù)防性治療。在后續(xù)的觀察過(guò)程中，每日于同一時(shí)間觀察記

4、錄各組小鼠的發(fā)病情況并給予疾病評(píng)分。最后通過(guò)疾病發(fā)病指數(shù)評(píng)分、脊髓病理分析，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACS)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)等方法檢測(cè)炎癥因子（TNF-α和IL-17A）水平對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià);進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟多種免疫細(xì)胞CD4/PD-1，CD19/PD-L1，CD4/CD25/Foxp3,CD19/CD21/CD23以及CD19/CD5/CD1dhi以及脊髓中相關(guān)功能分子的表達(dá)變化，探討雌激素和富馬酸二甲

5、酯可能的作用機(jī)制，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究雌激素與Breg及PD-1/PD-L1信號(hào)通路的關(guān)系，探討MMF通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子和黏附分子表達(dá)作用于EAE小鼠的可能作用機(jī)制。
　　[結(jié)果]
　　1、成功構(gòu)建EAE模型小鼠，發(fā)病小鼠神經(jīng)功能損害癥狀、LFB染色均符合典型EAE模型的病理和臨床特征。
　　2、雌激素治療后可有效延緩EAE小鼠的發(fā)病進(jìn)程，減輕脫髓鞘水平以及脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并下調(diào)外周炎癥因子TNF-α以及IL-17

6、A的分泌表達(dá)。
　　3、雌激素治療可下調(diào)T淋巴細(xì)胞表面活化分子CD69的表達(dá)，但與模型對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異;另一方面，雌激素治療可顯著上調(diào)CD4+T細(xì)胞表面PD-1以及CD19+B細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)，并顯著上調(diào)脾細(xì)胞中CD19+CD21 hiCD23low以及CD19+CD5+CD1dhi的比例，但對(duì)脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+的表達(dá)無(wú)明顯作用。
　　4、體外結(jié)果表明，雌激素能誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌表達(dá)IL-10，

7、上調(diào)IL-10+Breg細(xì)胞比例，并能夠上調(diào)PD-L1的表達(dá)及RBM47的蛋白水平。
　　5、DMF治療能夠緩解EAE小鼠的發(fā)病水平，減輕脊髓脫髓鞘水平及脊髓炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　6、體外結(jié)果表明，MMF可上調(diào)B細(xì)胞的IL-10及PD-L1的表達(dá)水平，并顯著下調(diào)黏附分子VCAM-1及趨化因子CXCL9的表達(dá)。
　　[結(jié)論]
　　1、雌激素和富馬酸二甲酯預(yù)防性治療可延緩EAE小鼠的發(fā)病進(jìn)程，對(duì)EAE起到一定治療作用