重組白介素35對(duì)小鼠哮喘免疫調(diào)節(jié)和治療作用的研究.pdf

1、[背景及目的]:
　　 支氣管哮喘（哮喘）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的慢性呼吸道炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。臨床主要以藥物控制為主，目前最有效的免疫治療方法為變應(yīng)原特異性免疫治療，但仍存弊端如超敏反應(yīng)、變應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)化、療程長(zhǎng)、次數(shù)多、患者依從性差，從而影響療效。因此尋找更為安全、有效的免疫治療方法是當(dāng)今變態(tài)反應(yīng)性疾病防治的熱點(diǎn)之一。
　　 研究表明哮喘發(fā)病與輔助性T細(xì)胞1、2(Th1/Th2)的細(xì)胞因子失衡、調(diào)節(jié)性

2、T細(xì)胞(regular T cells，Tregs)及輔助性T細(xì)胞17(T help cell17，Th17)/白細(xì)胞介素17(IL-17)等異常有關(guān);而白細(xì)胞介素35(IL-35)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，其與Tregs及Th17/IL-17等免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，通過(guò)多種途徑參與哮喘的發(fā)病和調(diào)節(jié)，有望成為哮喘的治療新靶點(diǎn)，也已成為近年研究的熱點(diǎn)。研究證實(shí)，IL-35能有效增強(qiáng)Treg亞群的功能，并且有效抑制Th17細(xì)胞的增殖分化，抑制

3、機(jī)體過(guò)度的免疫反應(yīng)，阻止炎癥對(duì)機(jī)體的免疫損傷等作用，因此我們認(rèn)為IL-35可能對(duì)支氣管哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病具有免疫調(diào)節(jié)和治療作用。
　　 我們擬通過(guò)重組構(gòu)建小鼠IL-35其真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)篩選出穩(wěn)定表達(dá)IL-35蛋白的細(xì)胞株，利用鎳柱(Ni-NTA)純化培養(yǎng)細(xì)胞的上清，最后將純化所得有活性的IL-35蛋白腹腔注射干預(yù)小鼠哮喘模型，觀察其對(duì)小鼠哮喘動(dòng)物模型激發(fā)后急性發(fā)作、氣道炎癥的影響，希望

4、闡明重組IL-35在過(guò)敏性哮喘等變態(tài)性疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，探討其在變態(tài)反應(yīng)疾病的免疫治療中的應(yīng)用前景。
　　 [內(nèi)容及方法]:
　　 第一部分真核表達(dá)質(zhì)粒pSectag2A-IL-35的構(gòu)建與表達(dá)
　　 從J774細(xì)胞中獲得編碼小鼠IL-12的p35亞基（IL-12 p35或p35）和EB病毒誘導(dǎo)基因3(EBI3) cDNA片段，退火獲得Linker，分別插入真核表達(dá)載體pSectag2A。重組質(zhì)粒pSec

5、tag2A-IL-35測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，反復(fù)篩選后獲得高效表達(dá)的細(xì)胞株，收集上清，濃縮后親和層析獲得純化的重組IL-35蛋白。
　　 第二部分IL-35對(duì)小鼠哮喘動(dòng)物模型的免疫調(diào)節(jié)作用
　　 1、建立小鼠哮喘動(dòng)物模型:SPF級(jí)C57BL/6小鼠12只，隨機(jī)分為對(duì)照組和哮喘組，每組6只。(1)致敏:哮喘組每只小鼠分別于第0和第7d腹腔內(nèi)注射0.2 mL含10μg卵蛋白(OVA)和2.25mg氫氧化鋁凝膠的生理鹽水

6、(NS);對(duì)照組僅予以0.2 mL含2.25 mg氫氧化鋁凝膠的NS。(2)激發(fā):哮喘組于第14～18 d霧化吸入10 mL NS（含5％ OVA），30 min/d，對(duì)照組僅吸入10 mLNS。(3)末次霧化24h后以1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，收集肺泡灌洗液(BALF)和肺組織標(biāo)本，檢測(cè)BALF中淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目及上清中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ的含量;同時(shí)肺組織H&E染色檢測(cè)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 2、IL

7、-35對(duì)小鼠哮喘動(dòng)物模型的免疫影響:SPF級(jí)C57BL/6小鼠18只，隨機(jī)分為3組，A組:正常對(duì)照組;B組:哮喘組;C組:IL-35治療組每組6只。(1)致敏:哮喘組及IL-35治療組每只小鼠分別于第0和第7d腹腔內(nèi)注射0.2 mL含10μgOVA和2.25mg氫氧化鋁凝膠的NS;A組僅予以0.2 mL含2.25 mg氫氧化鋁凝膠的NS。(2)干預(yù):C組于第7～13 d腹腔注射重組IL-35蛋白，10μg/d/mouse。(3)激發(fā):B

8、組及C組于第14～18 d霧化吸入10 mL NS（含5％ OVA），30 min/d，A組僅吸入10 mL NS。(4)檢測(cè):末次霧化24 h后，以1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，收集BALF和肺組織，分別檢測(cè)BALF中淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目及上清中細(xì)胞因子IL-4、IL-17、TGF-β、IFN-γ的含量;同時(shí)肺組織H&E染色及免疫組化檢測(cè)肺組織中叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子P3(FoxP3)和IL-17蛋白的表達(dá);最后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

9、
　　 [研究結(jié)果]:
　　 1、以J774細(xì)胞總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR克隆EBI3及p35 cDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在624 bp、576 bp處均可見(jiàn)單一條帶，大小與預(yù)計(jì)相符合。測(cè)序結(jié)果與Genbank(NM_015766.2、NM_001159424.1)中公布的序列一致;并通過(guò)退火獲得5(1)bp的Linker，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]。
　　 2、將兩者分別通過(guò)TA克隆連接至載體pSectag2

10、A中，最后將Linker連接至pSectag2A-EBI3-p35，構(gòu)建為重組質(zhì)粒pSectag2A-IL-35，經(jīng)PCR鑒定證實(shí)了目的基因的插入，經(jīng)雙酶切鑒定正確，多個(gè)引物測(cè)序證實(shí)讀碼框完整，無(wú)移碼突變，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;用Fugene9轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中，并用Zeocin篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株，篩選18 d獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞CHO/pSectag2A-IL-35，利用鎳柱純化細(xì)胞培養(yǎng)上清液，SDS-PAGE在46.3 kDa處可見(jiàn)一條帶，West

11、ern-Blot分析可見(jiàn)同樣大小的特異條帶，且能與組氨酸(HIS)標(biāo)簽抗體抗或IL-12 p35特異性抗體結(jié)合，表明成功建立細(xì)胞系CHO/pSectag2A-IL-35，并獲得小鼠IL-35蛋白。
　　 3、成功建立哮喘模型。致敏前后，觀察哮喘組和對(duì)照組小鼠的外觀和行為以及對(duì)刺激的反應(yīng)、活動(dòng)和體重均無(wú)明顯差異。激發(fā)后第2d哮喘組小鼠霧化時(shí)出現(xiàn)抓鼻撓腮行為，停止霧化后逐漸消失，第4d，哮喘組小鼠霧化時(shí)出現(xiàn)或煩躁不安或安靜少動(dòng)、或呼

12、吸加快加深或點(diǎn)頭呼吸、弓背直立、前肢縮抬、二便失禁和皮毛無(wú)光現(xiàn)象。對(duì)照組小鼠飲食正常，活動(dòng)靈敏，皮毛清潔有光澤。末次霧化24 h后收集標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，哮喘組較對(duì)照組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞比例增加、細(xì)胞因子IL-4升高和IFN-γ降低;H&E染色示肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加;這與哮喘患者Th2功能亢進(jìn)、Th1功能低下的免疫異常相吻合。結(jié)果證明成功建立小鼠哮喘模型，并可應(yīng)用于IL-35對(duì)哮喘免疫調(diào)節(jié)與治療作用的研究。
　

13、　 4、 IL-35治療后，B組BALF中IL-4、IL-17、TGF-β表達(dá)顯著高A組，C組IL-4、IL-17、TGF-β表達(dá)水平回降，低于B組，高于A組，而IFN-γ在BALF中的表達(dá)與前三者相反，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。H&E染色顯示C組小鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較B組明顯下降，高于A組主要以嗜酸性粒細(xì)胞為主，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，C組FoxP3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最低，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的IL

14、-35誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)型T細(xì)胞（iTr35）不表達(dá)FoxP3相一致;B組的IL-17陽(yáng)性表達(dá)顯著升高，高于A組和C組。結(jié)果示，經(jīng)腹腔注射重組IL-35，可顯著抑制哮喘動(dòng)物模型的氣道炎癥，并可上調(diào)Tregs增殖分化、抑制IL-17的表達(dá)，表明重組IL-35對(duì)小鼠哮喘具有免疫調(diào)節(jié)和治療作用。
　　 [結(jié)論]:
　　 1、通過(guò)PCR調(diào)取IL-35基因，利用分子克隆技術(shù)插入pSectag2A分泌型表達(dá)質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了pSectag2