基于胃腸道代謝的黃芩、連翹藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、傳統(tǒng)中藥多以水煎劑形式口服給藥，中藥經(jīng)口服進(jìn)入機(jī)體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)可能不僅有原型成分，也有體內(nèi)代謝產(chǎn)物。為了闡明中醫(yī)臨床常用清熱中藥黃芩、連翹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究從胃腸道代謝角度出發(fā)，通過(guò)體外模擬、體內(nèi)代謝研究相結(jié)合，考察黃芩、連翹水煎液及其主要成分的胃腸代謝物并對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗補(bǔ)體、抗菌及抗內(nèi)毒素活性評(píng)價(jià)，結(jié)果證明水煎液及其主要成分經(jīng)腸道菌代謝后活性增強(qiáng)（去甲漢黃芩素/羥基酪醇）。采用偽無(wú)菌動(dòng)物模型，結(jié)合代謝組學(xué)、血清藥物化學(xué)及藥物

2、代謝動(dòng)力學(xué)考察腸道菌群對(duì)黃芩、連翹主要成分體內(nèi)代謝和吸收，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并證明了腸道菌代謝產(chǎn)物為黃芩、連翹發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究以及中藥現(xiàn)代化研究提供新的思路。
　　1．本研究首先采用ERIC-PCR指紋圖譜分析技術(shù)對(duì)常用的兩種腸道菌孵育方法進(jìn)行比較，確立了一種與新鮮糞便的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似且較穩(wěn)定的腸道菌孵育方法。
　　2.黃芩體外模擬人胃腸代謝及活性代謝產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)黃芩水煎液的主要成分在人腸道菌中發(fā)

3、生代謝，代謝后抗補(bǔ)體、抗菌及抗內(nèi)毒素活性增強(qiáng)，活性最強(qiáng)的為代謝產(chǎn)物去甲基漢黃芩素。
　　首次從黃芩藥材中分離得到去甲基漢黃芩苷，對(duì)黃芩中8個(gè)主要黃酮類(lèi)成分進(jìn)行含量測(cè)定，黃芩苷、漢黃芩苷、去甲基漢黃芩苷、千層紙素 A苷、去甲基漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素 A在黃芩水煎液中含量分別為110.72±4.25、35.49±2.78、7.52±0.04、16.34±0.51、1.53±0.22、39.27±2.93、12.10±0.

4、15、3.25±0.21 mg/g生藥。研究發(fā)現(xiàn)黃芩水煎液在人工腸液、人工胃液中穩(wěn)定，沒(méi)有代謝產(chǎn)物生成。通過(guò)UPLC-QTOF/MS分析黃芩水煎液中主要成分黃芩苷、漢黃芩苷及千層紙素A苷在人腸道菌中代謝過(guò)程發(fā)現(xiàn)，黃芩苷轉(zhuǎn)化成苷元黃芩素以及黃芩素甲基化產(chǎn)物千層紙素A，漢黃芩苷轉(zhuǎn)化成苷元漢黃芩素及脫甲基產(chǎn)物去甲基漢黃芩素，千層紙素A苷轉(zhuǎn)化成苷元千層紙素A及脫甲基產(chǎn)物黃芩素。黃芩水煎液在人腸道菌中發(fā)生的主要代謝變化為各黃酮苷代謝生成其苷元，代

5、謝速率較單體化合物慢。
　　體外活性測(cè)試證明黃芩水煎液對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)不具有抑制作用，經(jīng)腸道菌代謝后顯示該作用；腸道菌代謝產(chǎn)物黃芩素、千層紙素 A及去甲基漢黃芩素經(jīng)典途徑和旁路途徑均對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)有抑制作用，且對(duì)凝血系統(tǒng)無(wú)顯著影響，其中去甲基漢黃芩素活性（CP50=0.138±0.004 mg/mL；AP50=0.147±0.008 mg/mL）最強(qiáng)。同樣，黃芩水煎液經(jīng)腸道菌代謝后抗菌、抗內(nèi)毒素活性增強(qiáng)。黃芩中主要黃酮苷類(lèi)成分及相應(yīng)腸道菌代

6、謝產(chǎn)物抗菌活性研究表明，黃芩苷及代謝產(chǎn)物黃芩素、去甲基漢黃芩素、黃芩素及千層紙素A具有抗菌活性，代謝產(chǎn)物抗菌、抗內(nèi)毒素活性強(qiáng)于原型黃酮苷類(lèi)成分，其中抗菌活性最強(qiáng)的是去甲基漢黃芩素，抗內(nèi)毒素活性最強(qiáng)的是去甲基漢黃芩素和黃芩素。
　　去甲基漢黃芩素為黃芩經(jīng)腸道菌代謝后活性最強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，可能經(jīng)體內(nèi)過(guò)程富集而發(fā)揮藥效。
　　3.連翹體外模擬人胃腸代謝及活性代謝產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)連翹水煎液的主要成分在人腸道菌中發(fā)生代謝，代謝后抗補(bǔ)體、

7、抗菌及抗內(nèi)毒素活性增強(qiáng)，活性最強(qiáng)的為代謝產(chǎn)物羥基酪醇。
　　從連翹藥材中分離得到6個(gè)化合物，分別為木脂素類(lèi)成分(+)-連翹苷、(+)-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、(+)-松脂素單甲基醚-4-O-β-D-葡萄糖苷、(-)-羅漢松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、(-)-松脂素單甲基醚-4-O-β-D-葡萄糖苷及苯乙醇苷類(lèi)成分連翹酯苷E。對(duì)連翹藥材中含量較高的苯乙醇苷類(lèi)成分連翹酯苷A及木脂素類(lèi)成分連翹苷、松脂素-4-O-β-D-葡

8、萄糖苷進(jìn)行含量測(cè)定，其在連翹水煎液中含量為28.37±0.03、3.74±0.02、3.512±0.01 mg/g生藥。研究發(fā)現(xiàn)連翹水煎液在人工胃液、人工腸液中穩(wěn)定，沒(méi)有代謝產(chǎn)物生成。連翹中最主要的苯乙醇苷類(lèi)化合物連翹酯苷 A在人腸道菌中首先水解為羥基酪醇和咖啡酸，咖啡酸在腸道菌群作用下還原生成3,4-二羥基苯丙酸。木脂素類(lèi)化合物連翹苷在人腸道菌代謝作用下生成苷元連翹脂素、連翹脂素脫甲基產(chǎn)物L(fēng)antibetin、Lantibetin單鍵

9、斷裂產(chǎn)物1,2-Benzenediol,4-[(2S,3R,4R)-4-[(3,4-dimethoxyphenyl) methyl] tetrahydro-3-(hydroxymethyl)-2-furanyl]和腸內(nèi)脂；松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷在人腸道菌中代謝生成苷元松脂素、開(kāi)環(huán)異落葉松脂素、落葉松脂醇、腸內(nèi)脂、(2R,3R)-2,3-Bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)butyrolactone、(-

10、)-(2R,3R)-3-(3′′-hydroxybenzyl)-2-(4′-hydroxy-3′-methoxybenzyl) butyrolactone。連翹腸道菌代謝主要反應(yīng)類(lèi)型有水解、脫甲基、還原、縮合、氧化、脫羥基化；水煎液在人腸道菌代謝速率較單體成分慢。
　　連翹水煎液對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)不具有抑制作用，其腸道菌代謝后樣品顯示該作用。木脂素類(lèi)成分及相應(yīng)腸道菌代謝產(chǎn)物不具有抗補(bǔ)體活性，苯乙醇苷類(lèi)成分連翹酯苷A的腸道菌代謝產(chǎn)物羥基酪醇

11、、3,4-二羥基苯丙酸具有抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的作用，對(duì)凝血系統(tǒng)無(wú)顯著影響，活性最強(qiáng)的是羥基酪醇（CP50=0.096±0.007 mg/mL；AP50=0.121±0.012 mg/mL）。同樣，體外活性測(cè)試表明連翹水煎液經(jīng)腸道菌代謝后抗菌、抗內(nèi)毒素活性增強(qiáng)。木脂素類(lèi)成分及相應(yīng)腸道菌代謝產(chǎn)物不具有抗菌、抗內(nèi)毒素活性；苯乙醇苷類(lèi)成分連翹酯苷A及腸道菌代謝產(chǎn)物羥基酪醇、3,4-二羥基苯丙酸具有抑菌、抗內(nèi)毒素活性，羥基酪醇活性最強(qiáng)。
　　羥基

12、酪醇為連翹經(jīng)腸道菌代謝后活性最強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，可能經(jīng)體內(nèi)過(guò)程富集而發(fā)揮藥效，連翹藥理作用的發(fā)揮依賴(lài)于腸道菌群的代謝作用，真正起作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能為經(jīng)腸道菌代謝后的代謝產(chǎn)物而非原型成分。
　　4.腸道菌對(duì)黃芩、連翹主要成分代謝、吸收影響研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生水解、葡萄糖醛酸結(jié)合、甲基化/脫甲基反應(yīng)；腸道菌群可以通過(guò)影響肝腸循環(huán)/腸道菌代謝作用影響中藥成分體內(nèi)代謝及吸收過(guò)程。
　　使用廣譜抗生素塑造偽無(wú)菌大鼠模

13、型，比較黃芩、連翹主要成分在偽無(wú)菌大鼠及普通大鼠腸道菌中代謝差異，結(jié)果顯示腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂影響其腸道菌代謝產(chǎn)物的種類(lèi)及生成速率。比較黃芩、連翹主要成分在普通大鼠及人腸道菌體外代謝過(guò)程，結(jié)果顯示由于人與大鼠腸道菌間存在差異，導(dǎo)致中藥代謝產(chǎn)物生成速率、種類(lèi)在人、鼠腸道菌代謝過(guò)程中有所不同。
　　通過(guò)UPLC-QTOF/MS技術(shù)分析黃芩、連翹主要成分灌胃給予普通大鼠及偽無(wú)菌大鼠的盲腸內(nèi)容物、尿液代謝產(chǎn)物，結(jié)果證明中藥成分在普通大鼠體內(nèi)主

14、要發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合、甲基化/脫甲基及水解反應(yīng)，而偽無(wú)菌大鼠中沒(méi)有代謝產(chǎn)物生成。對(duì)偽無(wú)菌大鼠和普通大鼠灌胃給予黃芩、連翹主要成分后尿液樣品進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選引起兩組間尿液差異的代謝標(biāo)記物。結(jié)果顯示差異代謝標(biāo)記物包括氨基酸代謝產(chǎn)物和中藥成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物，表明腸道菌群對(duì)維持宿主健康及正常代謝具重要意義。
　　黃芩及連翹主要成分灌胃給予偽無(wú)菌大鼠及普通大鼠后其血漿中原型成分及腸道菌代謝產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué)比較結(jié)果顯示，腸道菌受到抑制后會(huì)