基于胃腸道代謝的黃芩、連翹藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、傳統(tǒng)中藥多以水煎劑形式口服給藥，中藥經(jīng)口服進入機體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)可能不僅有原型成分，也有體內(nèi)代謝產(chǎn)物。為了闡明中醫(yī)臨床常用清熱中藥黃芩、連翹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究從胃腸道代謝角度出發(fā)，通過體外模擬、體內(nèi)代謝研究相結(jié)合，考察黃芩、連翹水煎液及其主要成分的胃腸代謝物并對代謝產(chǎn)物進行抗補體、抗菌及抗內(nèi)毒素活性評價，結(jié)果證明水煎液及其主要成分經(jīng)腸道菌代謝后活性增強（去甲漢黃芩素/羥基酪醇）。采用偽無菌動物模型，結(jié)合代謝組學(xué)、血清藥物化學(xué)及藥物

2、代謝動力學(xué)考察腸道菌群對黃芩、連翹主要成分體內(nèi)代謝和吸收，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并證明了腸道菌代謝產(chǎn)物為黃芩、連翹發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究以及中藥現(xiàn)代化研究提供新的思路。
　　1．本研究首先采用ERIC-PCR指紋圖譜分析技術(shù)對常用的兩種腸道菌孵育方法進行比較，確立了一種與新鮮糞便的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似且較穩(wěn)定的腸道菌孵育方法。
　　2.黃芩體外模擬人胃腸代謝及活性代謝產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)黃芩水煎液的主要成分在人腸道菌中發(fā)

3、生代謝，代謝后抗補體、抗菌及抗內(nèi)毒素活性增強，活性最強的為代謝產(chǎn)物去甲基漢黃芩素。
　　首次從黃芩藥材中分離得到去甲基漢黃芩苷，對黃芩中8個主要黃酮類成分進行含量測定，黃芩苷、漢黃芩苷、去甲基漢黃芩苷、千層紙素 A苷、去甲基漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素 A在黃芩水煎液中含量分別為110.72±4.25、35.49±2.78、7.52±0.04、16.34±0.51、1.53±0.22、39.27±2.93、12.10±0.

4、15、3.25±0.21 mg/g生藥。研究發(fā)現(xiàn)黃芩水煎液在人工腸液、人工胃液中穩(wěn)定，沒有代謝產(chǎn)物生成。通過UPLC-QTOF/MS分析黃芩水煎液中主要成分黃芩苷、漢黃芩苷及千層紙素A苷在人腸道菌中代謝過程發(fā)現(xiàn)，黃芩苷轉(zhuǎn)化成苷元黃芩素以及黃芩素甲基化產(chǎn)物千層紙素A，漢黃芩苷轉(zhuǎn)化成苷元漢黃芩素及脫甲基產(chǎn)物去甲基漢黃芩素，千層紙素A苷轉(zhuǎn)化成苷元千層紙素A及脫甲基產(chǎn)物黃芩素。黃芩水煎液在人腸道菌中發(fā)生的主要代謝變化為各黃酮苷代謝生成其苷元，代

5、謝速率較單體化合物慢。
　　體外活性測試證明黃芩水煎液對補體系統(tǒng)不具有抑制作用，經(jīng)腸道菌代謝后顯示該作用；腸道菌代謝產(chǎn)物黃芩素、千層紙素 A及去甲基漢黃芩素經(jīng)典途徑和旁路途徑均對補體系統(tǒng)有抑制作用，且對凝血系統(tǒng)無顯著影響，其中去甲基漢黃芩素活性（CP50=0.138±0.004 mg/mL；AP50=0.147±0.008 mg/mL）最強。同樣，黃芩水煎液經(jīng)腸道菌代謝后抗菌、抗內(nèi)毒素活性增強。黃芩中主要黃酮苷類成分及相應(yīng)腸道菌代

6、謝產(chǎn)物抗菌活性研究表明，黃芩苷及代謝產(chǎn)物黃芩素、去甲基漢黃芩素、黃芩素及千層紙素A具有抗菌活性，代謝產(chǎn)物抗菌、抗內(nèi)毒素活性強于原型黃酮苷類成分，其中抗菌活性最強的是去甲基漢黃芩素，抗內(nèi)毒素活性最強的是去甲基漢黃芩素和黃芩素。
　　去甲基漢黃芩素為黃芩經(jīng)腸道菌代謝后活性最強的代謝產(chǎn)物，可能經(jīng)體內(nèi)過程富集而發(fā)揮藥效。
　　3.連翹體外模擬人胃腸代謝及活性代謝產(chǎn)物的研究，發(fā)現(xiàn)連翹水煎液的主要成分在人腸道菌中發(fā)生代謝，代謝后抗補體、

7、抗菌及抗內(nèi)毒素活性增強，活性最強的為代謝產(chǎn)物羥基酪醇。
　　從連翹藥材中分離得到6個化合物，分別為木脂素類成分(+)-連翹苷、(+)-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、(+)-松脂素單甲基醚-4-O-β-D-葡萄糖苷、(-)-羅漢松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、(-)-松脂素單甲基醚-4-O-β-D-葡萄糖苷及苯乙醇苷類成分連翹酯苷E。對連翹藥材中含量較高的苯乙醇苷類成分連翹酯苷A及木脂素類成分連翹苷、松脂素-4-O-β-D-葡

8、萄糖苷進行含量測定，其在連翹水煎液中含量為28.37±0.03、3.74±0.02、3.512±0.01 mg/g生藥。研究發(fā)現(xiàn)連翹水煎液在人工胃液、人工腸液中穩(wěn)定，沒有代謝產(chǎn)物生成。連翹中最主要的苯乙醇苷類化合物連翹酯苷 A在人腸道菌中首先水解為羥基酪醇和咖啡酸，咖啡酸在腸道菌群作用下還原生成3,4-二羥基苯丙酸。木脂素類化合物連翹苷在人腸道菌代謝作用下生成苷元連翹脂素、連翹脂素脫甲基產(chǎn)物L(fēng)antibetin、Lantibetin單鍵

9、斷裂產(chǎn)物1,2-Benzenediol,4-[(2S,3R,4R)-4-[(3,4-dimethoxyphenyl) methyl] tetrahydro-3-(hydroxymethyl)-2-furanyl]和腸內(nèi)脂；松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷在人腸道菌中代謝生成苷元松脂素、開環(huán)異落葉松脂素、落葉松脂醇、腸內(nèi)脂、(2R,3R)-2,3-Bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)butyrolactone、(-

10、)-(2R,3R)-3-(3′′-hydroxybenzyl)-2-(4′-hydroxy-3′-methoxybenzyl) butyrolactone。連翹腸道菌代謝主要反應(yīng)類型有水解、脫甲基、還原、縮合、氧化、脫羥基化；水煎液在人腸道菌代謝速率較單體成分慢。
　　連翹水煎液對補體系統(tǒng)不具有抑制作用，其腸道菌代謝后樣品顯示該作用。木脂素類成分及相應(yīng)腸道菌代謝產(chǎn)物不具有抗補體活性，苯乙醇苷類成分連翹酯苷A的腸道菌代謝產(chǎn)物羥基酪醇

11、、3,4-二羥基苯丙酸具有抑制補體系統(tǒng)的作用，對凝血系統(tǒng)無顯著影響，活性最強的是羥基酪醇（CP50=0.096±0.007 mg/mL；AP50=0.121±0.012 mg/mL）。同樣，體外活性測試表明連翹水煎液經(jīng)腸道菌代謝后抗菌、抗內(nèi)毒素活性增強。木脂素類成分及相應(yīng)腸道菌代謝產(chǎn)物不具有抗菌、抗內(nèi)毒素活性；苯乙醇苷類成分連翹酯苷A及腸道菌代謝產(chǎn)物羥基酪醇、3,4-二羥基苯丙酸具有抑菌、抗內(nèi)毒素活性，羥基酪醇活性最強。
　　羥基

12、酪醇為連翹經(jīng)腸道菌代謝后活性最強的代謝產(chǎn)物，可能經(jīng)體內(nèi)過程富集而發(fā)揮藥效，連翹藥理作用的發(fā)揮依賴于腸道菌群的代謝作用，真正起作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能為經(jīng)腸道菌代謝后的代謝產(chǎn)物而非原型成分。
　　4.腸道菌對黃芩、連翹主要成分代謝、吸收影響研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生水解、葡萄糖醛酸結(jié)合、甲基化/脫甲基反應(yīng)；腸道菌群可以通過影響肝腸循環(huán)/腸道菌代謝作用影響中藥成分體內(nèi)代謝及吸收過程。
　　使用廣譜抗生素塑造偽無菌大鼠模

13、型，比較黃芩、連翹主要成分在偽無菌大鼠及普通大鼠腸道菌中代謝差異，結(jié)果顯示腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂影響其腸道菌代謝產(chǎn)物的種類及生成速率。比較黃芩、連翹主要成分在普通大鼠及人腸道菌體外代謝過程，結(jié)果顯示由于人與大鼠腸道菌間存在差異，導(dǎo)致中藥代謝產(chǎn)物生成速率、種類在人、鼠腸道菌代謝過程中有所不同。
　　通過UPLC-QTOF/MS技術(shù)分析黃芩、連翹主要成分灌胃給予普通大鼠及偽無菌大鼠的盲腸內(nèi)容物、尿液代謝產(chǎn)物，結(jié)果證明中藥成分在普通大鼠體內(nèi)主

14、要發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合、甲基化/脫甲基及水解反應(yīng)，而偽無菌大鼠中沒有代謝產(chǎn)物生成。對偽無菌大鼠和普通大鼠灌胃給予黃芩、連翹主要成分后尿液樣品進行多元統(tǒng)計分析，篩選引起兩組間尿液差異的代謝標(biāo)記物。結(jié)果顯示差異代謝標(biāo)記物包括氨基酸代謝產(chǎn)物和中藥成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物，表明腸道菌群對維持宿主健康及正常代謝具重要意義。
　　黃芩及連翹主要成分灌胃給予偽無菌大鼠及普通大鼠后其血漿中原型成分及腸道菌代謝產(chǎn)物的藥代動力學(xué)比較結(jié)果顯示，腸道菌受到抑制后會