參七抗癌散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、參七抗癌散為武漢市科德中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，其處方源于張德忠教授祖?zhèn)髅胤剑晌餮髤?、三七、白花蛇舌草等十味中藥組方，具有益氣活血、軟堅散結(jié)、解毒止痛之功效。張德忠老中醫(yī)將該經(jīng)驗方劑臨床用于腫瘤患者40余年，治療病例數(shù)以千計，能改善患者癥狀，控制腫瘤發(fā)展，減輕病人痛苦，提高生存質(zhì)量，受到廣大患者歡迎。本論文在參七抗癌散臨床療效的基礎(chǔ)上，對其抗癌有效物質(zhì)進行了研究，旨在詮釋該醫(yī)院制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其臨床療效提供科學依據(jù)。
　　系統(tǒng)查閱

2、了參七抗癌散組方各單味藥的相關(guān)文獻資料，對方中各藥的主治功效、藥理作用和化學成分進行檢索，并對該中藥復(fù)方進行了方解。同時大量查閱了有關(guān)中藥復(fù)方抗腫瘤研究和中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究的文獻資料，學習他人的研究思路，借鑒別人的研究方法。在查閱文獻資料基礎(chǔ)上，完成本篇論文的綜述，為論文設(shè)計思路和課題研究提供了參考依據(jù)。
　　將參七抗癌散組方中藥視為整體，采用現(xiàn)代超臨界CO2萃取技術(shù)和傳統(tǒng)溶劑萃取法對其化學物質(zhì)進行了提取分離，分離為超臨界CO2

3、萃取物A、總多糖B、石油醚萃取物C、氯仿萃取物D、乙酸乙酯萃取物E、正丁醇萃取物F和水溶性物質(zhì)G等7個化學物質(zhì)部位；構(gòu)買了肺腺癌A549細胞模型，通過MTT法對上述不同化學物質(zhì)部位進行了抗癌活性篩選。結(jié)果表明，氯仿萃取物質(zhì)部位具有顯著抗癌活性，其他物質(zhì)部位抗癌活性不甚明顯，因此確定氯仿萃取物質(zhì)部位為該中藥復(fù)方的主要抗癌有效物質(zhì)部位。
　　采用HPLC-MS現(xiàn)代色譜技術(shù)，對氯仿萃取物質(zhì)部位的化學成分進行分析，鑒定了其中8個化合物，分

4、別為3-pyridine carboxylic acid, barbatin C, asperulosidic acid, deacetylasperuloside,2-cyclohexene-1-ketone, scutebarbatine F, barbatine D and scutebarbatine G。通過文獻檢索，上述化合物對多種癌細胞均有生物活性。
　　采用硅膠柱色譜和制備型高效液相色譜的分離技術(shù)，從參七抗癌散有效

5、物質(zhì)部位分離出8種單體成分，通過1H-NMR、13C-NMR、MS等現(xiàn)代波譜綜合分析方法，鑒定了其中的5個化合物，分別為柴胡次苷D(Prosaikogenin D)、柴胡次苷F(Prosaikogenin F)、β-谷甾醇、SS-6(3β,16β,23-三羥基-13,28-環(huán)氧烏蘇-11-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)、熊果酸甲酯。以A549細胞為授試對象，對上述化合物進行抗癌活性篩選研究，其IC50值分別為65.4、57.2、58

6、.9、4.9、88.4μg/mL。表明各化合物均具有不同程度的抗癌活性，其中化合物 SS-6(3β,16β,23-三羥基-13,28-環(huán)氧烏蘇-11-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)的抗癌活性尤其顯著。
　　在確定參七抗癌散組方的抗癌有效物質(zhì)部位及其有效成分的基礎(chǔ)上，通過MTT法測定細胞活力、熒光染色法測定細胞形態(tài)、流式細胞儀檢測細胞周期變化及細胞凋亡變化、蛋白活力測定、免疫印跡實驗等方法，探討了抗癌有效物質(zhì)的作用機理。研究結(jié)果

7、表明，氯仿萃取物對A549細胞增殖具有顯著抑制作用，且呈劑量和時間依賴性；人肺腺癌 A549細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)細胞凋亡典型特征，且隨著藥物濃度增加凋亡率升高；Western blot檢測了抗癌有效物質(zhì)對蛋白表達的影響，可激活Caspase-3、-8、-9，促凋亡基因Bax表達增強，抑凋亡基因Bcl-2表達下調(diào)，Bax／Bcl-2的比值明顯上升。故推測參七抗癌散有效物質(zhì)通過死亡受體途徑和線粒體途徑誘導(dǎo) A549肺癌細胞凋亡，并與其

8、上調(diào)促凋亡基因Bax和下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2表達相關(guān)。
　　通過Western blot試驗方法探討了化合物SS-6(3β,16β,23-三羥基-13,28-環(huán)氧烏蘇-11-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)抗人肺腺癌 A549細胞的作用機制。檢測了PI3K/Akt/mTOR通路，自噬作為細胞程序性死亡的另一種方式，我們同時也檢測了自噬相關(guān)的蛋白表達情況，結(jié)果表明化合物 SS-6可明顯抑制 A549細胞增殖，呈劑量依賴關(guān)系，可下

9、調(diào)Bcl-2的表達，上調(diào) Bax的表達；通過上調(diào) Bax/Bcl-2激活 Caspase蛋白家族，促使PARP剪切，因而推測經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)A549細胞凋亡。通過免疫印跡法檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路和自噬相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclinl、Atg5、Atg7、Atg12蛋白表達水平均明顯增高，說明該化合物對A549細胞 PI3K/AKT/mTOR信號途徑及其下游靶蛋白磷酸化具有抑制作用，從而表明參七抗