薏苡附子敗醬散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、制備工藝及藥效學(xué)研究.pdf

1、本文對(duì)白花敗醬草的化學(xué)成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)和全面的研究，分離了42個(gè)化合物，鑒定了其中的39個(gè)；建立了部分化學(xué)成分的高速逆流色譜快速分離制備技術(shù)平臺(tái)；在此基礎(chǔ)上優(yōu)選了薏苡附子敗醬散活性組分的制備工藝；與此同時(shí)，考察了分離所得部分化合物和薏苡附子敗醬散活性組分的體外抗氧化、體外體內(nèi)抗腫瘤活性；并初步制訂了該活性組分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 薏苡附子敗醬散是由薏苡仁、敗醬草和熟附子組成，主要用于抗菌、胃腸道和婦科疾病的治療。本文以全方和組方藥材為研

2、究對(duì)象，對(duì)白花敗醬草的化學(xué)成分進(jìn)行了較為全面的研究，建立了部分化合物快速、高效的分離制備平臺(tái)；在此基礎(chǔ)上優(yōu)選了該方抗腫瘤活性組分的制備工藝，并初步制定了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；最后，對(duì)所得部分化合物和活性組分進(jìn)行了體外抗氧化，體外和體內(nèi)抗腫瘤活性研究。 首先，對(duì)白花敗醬草化學(xué)成分進(jìn)行了較為系統(tǒng)和全面的研究。共分離得到42個(gè)化合物，經(jīng)理化反應(yīng)和光譜分析(UV、IR、HR-ESI-MS、1HNMR、13CNMR、DEPT、HMBC、HMQC和N

3、OESY)鑒定了其中的39個(gè)，分別為正三十二烷酸(No.1)、齊墩果酸(No.2)、熊果酸(No.3)、2a-羥基齊墩果酸(No.4)、2a-羥基熊果酸(No.5)、咖啡酸(No.6)、阿魏酸(No.7)、原兒茶酸(No.8)、沒(méi)食子酸(No.9)、β-谷甾醇(No.10)、7β-羥基-β-谷甾醇(No.11)、豆甾醇(No.12)、胡蘿卜苷(No.13)、金色酰胺醇酯(No.14)、5-羥基-7，3′，4′-三甲氧基黃酮(No.15)

4、、5-羥基-7，4′-二甲氧基黃酮(No.16)、木犀草素(No.17)、槲皮素(No.18)、異葒草苷(No.19)、異牡荊苷(No.20)、櫻黃素-8-C-葡萄糖苷(No.21)、槲皮甙(No.22)、莫羅忍冬甙(No.23)、白花敗醬醇甙(No.24)、bolusantholB(No.25)、tetrapterolI(No.26)、orotinin(No.27)、orotinin-5-methylether(No.28)、lico

5、agrochalconeB(No.29)、3′-異戊烯基芹黃素(No.30)、5，7，2′，4′-四羥基-8，3′-二異戊烯基二氫異黃酮(No.31)、(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6，8-二異戊烯基二氫黃酮(No.32)、(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-6-lavandulyl-二氫黃酮(No.33)、(2S)-5，7，2′，6′-四羥基-4′-lavandulyl-二氫黃酮(No.34)、(2S)-5，2′，6′-三羥

6、基-2″，2″-二甲基吡喃-[5″，6″∶6，7]-二氫黃酮(No.35)、(2S，3″S)-5，2′，6′-三羥基-3″-異戊烯基-2″，2″-二甲基-3″，4″-二氫吡喃-[5″，6″∶6，7]-二氫黃酮(No.36)、(2S)-5，2′，6′-三羥基-3″-異戊烯基-2″，2″-二甲基吡喃-[5″，6″∶6，7]-二氫黃酮(No.37)、(2S)-5，2′，6′-三羥基-6-lavandulyl-4″-異戊烯基-2″，2″-二甲基

7、吡喃-[5″，6″∶7，8]-二氫黃酮(No.38)、(2S)-5，2′，6′-三羥基-2″，2″-二甲基吡喃-[5″，6″∶7，8]-6-lavandulyl-二氫黃酮(No.39)。其中化合物No.32、No.33、No.34、No.35、No.36、No.37、No.38和No.39為新結(jié)構(gòu)的二氫黃酮類(lèi)化合物；除了化合物No.17、No.18、No.23和No.24以外，其余均為首次從敗醬屬植物中分離得到。這為白花敗醬草和薏苡附子

8、敗醬散的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供研究資料。 在分離制備當(dāng)中，除了傳統(tǒng)的柱色譜法以外，我們應(yīng)用高速逆流色譜(High-speedcounter-currentchromatography，HSCCC)等現(xiàn)代工程技術(shù)建立了部分化合物的快速、高效的分離制備平臺(tái)。藥材的乙醇提取物經(jīng)溶劑萃取或柱色譜法除雜后，以乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶3，v/v/v)為兩相溶劑體系對(duì)化合物No.19和No.20，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶0.6∶0.

9、6∶1，v/v/v/v)為兩相溶劑體系對(duì)化合物No.15、No.16和No.17，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶11∶11∶8，v/v/v/v)為兩相溶劑體系對(duì)化合物No.25、No.26和No.32，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶13∶13∶10，v/v/v/v)為兩相溶劑體系對(duì)化合物No.29、No.32、No.33、No.34、No.35和No.36進(jìn)行了快速制備；在正交試驗(yàn)法優(yōu)選最佳超臨界流體萃取(Supercrit

10、icalfluidextraction，SFE)的基礎(chǔ)上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1.2∶1.2∶1，v/v/v/v)為兩相溶劑體系對(duì)化合物No.14，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶6∶6∶6，v/v/v/v)為兩相溶劑體系對(duì)化合物No.27、No.28和No.29進(jìn)行了分離制備。同時(shí)也建立了化合物No.25、No.27、No.28、No.33、No.35、No.37和No.38的反相制備液相色譜分離法。這些簡(jiǎn)便、快速的制

11、備方法為中藥化學(xué)成分的研究提供了實(shí)例和借鑒。 除此之外，我們采用GC/MS對(duì)白花敗醬草揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，共分離出了46個(gè)峰，鑒定了其中的38個(gè)化合物，占總峰面積的93.98％。其主要化學(xué)成分為烷烴(48.5％)、脂肪酸(21.77％)、醛(15.63％)和甾醇(4.72％)，還有少量的脂肪醇、酮和呋喃類(lèi)化合物。其次，建立了薏苡附子敗醬散活性組分的制備工藝。用SFE提取薏苡仁油后，全方水提，提取物濃縮成0.5g/ml

12、的樣品液以5/6倍藥材量的D101大孔吸附樹(shù)脂為分離載體，用7倍樹(shù)脂體積的水洗脫后，再用7倍樹(shù)脂體積的75％乙醇洗脫，接收75％乙醇洗脫物，減壓干燥后與薏苡仁油混合即得薏苡附子敗醬散活性組分(YFBS)。接著，初步制定了薏苡附子敗醬散活性組分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以蘆丁為對(duì)照品，建立了活性組分中總黃酮的紫外分光光度含量分析法，以自制的異葒草苷和異牡荊苷為對(duì)照品，建立了活性組分中兩個(gè)指標(biāo)性成分的高效液相色譜含量分析法。 在藥效學(xué)研究中，考察

13、了白花敗醬草SFE萃取物、活性組分和四個(gè)單體化合物(No.32、No.33、No.36和No.38)在體外對(duì)自由基(羥基自由基、超氧陰離子、DPPH)的清除能力、H2O2所致大鼠紅細(xì)胞氧化溶血的保護(hù)作用和對(duì)小鼠肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化物L(fēng)PO的抑制作用。結(jié)果表明各樣品均具有一定的自由基清除作用(5.5μg/ml＜IC50＜121μg/ml)、對(duì)H2O2引起的大鼠紅細(xì)胞氧化溶血有一定的保護(hù)作用(7.0μg/ml＜IC50＜144μg/ml)、對(duì)

14、小鼠肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化物L(fēng)PO有一定的抑制作用(8.0μg/ml＜IC50＜213μg/ml)。其中，No.32、No.33、No.36和No.38號(hào)化合物表現(xiàn)出更強(qiáng)的體外抗氧化活性，IC50值均小于15μg/ml。 在體外抗腫瘤活性研究中，采用MTT法考察了YFBS和No.32～39號(hào)化合物對(duì)人腫瘤細(xì)胞株A549、BEL-7402、SGC-7901、MCF-7、HT-29、K562和A498的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果No.32、No

15、.33、No.34和No.39號(hào)化合物對(duì)各人腫瘤細(xì)胞株有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用，IC50均小于10μg/ml，其中No.32號(hào)化合物對(duì)各腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50＜5.0μg/ml，No.39號(hào)化合物對(duì)各腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50＜3.0μg/ml；No.38號(hào)化合物能選擇性的抑制人肝癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，IC50＜1.5μg/ml，對(duì)其它腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制較弱。No.35、No.36和No.37號(hào)化合物對(duì)各腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用較弱，IC50

16、＞10μg/ml。YFBS對(duì)各腫瘤細(xì)胞株也表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)抑制作用，IC50在12～33μg/ml之間。這為進(jìn)一步的體內(nèi)抗腫瘤作前期研究。 在體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)中，對(duì)YFBS和No.32號(hào)化合物進(jìn)行了小鼠體內(nèi)S180肉瘤生長(zhǎng)的抑制作用研究。結(jié)果：YFBS口腹給藥1.0g/kg、No.32號(hào)化合物腹腔注射給藥40mg/kg時(shí)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)到了56.9％和57.2％，并呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。YFBS和No.32號(hào)化合物與小

17、劑量(10mg/kg)的CTX合用即可達(dá)到顯著的抑瘤效果，抑瘤率分別為54.8％和57.1％，而且能改善CTX所致的小鼠脾指數(shù)升高、胸腺指數(shù)降低、白細(xì)胞數(shù)降低、體重減輕，飲食不良，行動(dòng)遲緩等毒副作用，提示YFBS和No.32號(hào)化合物可用于臨床細(xì)胞毒藥物化療的輔助用藥，發(fā)揮增效減毒作用。同時(shí)也進(jìn)行了YFBS對(duì)荷瘤小鼠的生存期試驗(yàn)，結(jié)果口腹給藥0.25、0.5和1.0g/kg時(shí)，小鼠的生存期分別延長(zhǎng)了27.4％、37.9％和45.3％，均優(yōu)

18、于環(huán)磷酰胺(26.3％)并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。所得結(jié)果提示YFBS和No.32號(hào)化合物有望開(kāi)發(fā)成為現(xiàn)代中藥新藥。有關(guān)YFBS和No.32號(hào)化合物對(duì)其它腫瘤模型的作用、作用機(jī)制及臨床應(yīng)用意義等還需要進(jìn)一步的研究與探討。 總之，本文對(duì)白花敗醬草的化學(xué)成分進(jìn)行了較為全面的研究，建立了部分化合物快速制備平臺(tái)，也建立了活性組分的制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、并進(jìn)行了相關(guān)藥效學(xué)研究，在探索中藥材和中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的同時(shí)，也為開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)