淀粉樣前體蛋白及其裂解產(chǎn)物在人卵巢中的表達(dá)及其與輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局的關(guān)系.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分:淀粉樣前體蛋白及其裂解產(chǎn)物在人卵巢中的表達(dá)及其與卵巢儲備和卵巢反應(yīng)性的關(guān)系
　　目的:
　　探討IVF-ET周期中，APP在IVF/ICSI患者卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40在卵泡液中的表達(dá)與卵巢儲備、卵巢反應(yīng)性是否相關(guān)。了解APP在人卵巢組織以及小鼠卵巢組織、子宮內(nèi)膜、骨骼肌的表達(dá)情況。
　　方法:
　　1.選擇2013年6月至2

2、013年9月于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI治療并且使用長方案的患者，排除多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、有卵巢手術(shù)史、嚴(yán)重男方因素性不育的患者，共納入51例不孕患者。
　　2.用Ficoll梯度離心法分離拾卵后的所有卵泡液、獲取顆粒細(xì)胞，采用Western blotting方法測定顆粒細(xì)胞APP的表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析。
　　3.從病理科收集手術(shù)切除的人卵巢組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)方法檢測APP在人卵

3、巢組織中的定位表達(dá)。同時采用疫組織化學(xué)方法比較APP在小鼠卵巢組織、骨骼肌、子宮內(nèi)膜的定位表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.Western blotting結(jié)果顯示，APP表達(dá)于IVF/ICSI患者的卵巢顆粒細(xì)胞;ELISA結(jié)果顯示， sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40存在于IVF/ICSI患者的卵泡液中。
　　2.不孕患者卵巢顆粒細(xì)胞的APP相對表達(dá)量與AFC之間存在顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.448(P＜0.

4、05)，IVF/ICSI患者卵巢顆粒細(xì)胞的APP相對表達(dá)量與獲卵數(shù)之間也存在顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.467(P＜0.05)。
　　3.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，APP在人卵巢組織的顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞及卵子呈陽性表達(dá)，APP在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞和卵子、骨骼肌以及子宮內(nèi)膜均呈陽性表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.APP存在于不孕患者卵巢顆粒細(xì)胞，sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40存在于不孕患者卵泡液中。且APP與AFC、獲

5、卵數(shù)之間呈顯著負(fù)相關(guān)，提示卵巢顆粒細(xì)胞APP表達(dá)與IVF/ICSI患者卵巢儲備、卵巢反應(yīng)性相關(guān)。
　　2.不孕患者卵泡液中sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40水平可能與AFC及獲卵數(shù)無相關(guān)性。由于本研究所選標(biāo)本較少，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。
　　3.APP在小鼠卵巢組織的顆粒細(xì)胞、卵子及子宮內(nèi)膜陽性表達(dá)，提示APP可能與小鼠生育力相關(guān)。
　　第二部分:淀粉樣前體蛋白及其裂解產(chǎn)物與輔助生殖技術(shù)妊娠結(jié)局的關(guān)系

6、>　　目的:
　　探討IVF-ET周期中，APP在IVF/ICSI患者卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40在卵泡液中表達(dá)與IVF/ICSI妊娠結(jié)局是否相關(guān)。
　　方法:
　　1.選擇2013年6月至2013年9月于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心使用GnRHa長方案行IVF/ICSI-ET治療的51例患者，排除多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥、有卵巢手術(shù)史、嚴(yán)重男方因素性不育的患者。經(jīng)拾卵后的

7、所有卵泡穿刺液用Ficoll梯度離心法分離顆粒細(xì)胞，采用Western blotting方法測定顆粒細(xì)胞APP的表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法測定取卵日卵泡液的sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40水平。記錄兩原核數(shù)、胚胎數(shù)、≤5％碎片的8細(xì)胞胚胎數(shù)、種植率、取消移植率、臨床妊娠率等指標(biāo)。
　　2.數(shù)據(jù)分析時，首先將51例不孕患者按經(jīng)IVF-ET治療是否獲得妊娠分為兩組，臨床妊娠組和非妊娠組，比

8、較兩組患者APP及其裂解產(chǎn)物sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40的表達(dá)水平是否有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.連續(xù)變量進(jìn)行正態(tài)分布性檢驗，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。如果數(shù)據(jù)是正態(tài)分布的話，組間的比較采用t-test或者是One Way ANOVA。如果數(shù)據(jù)是非正態(tài)分布的話，組間的比較采用Wilcoxon Sign Rank test或者是Kruskal-Wallis test。
　　結(jié)果：
　　1.妊娠組的Aβ40水平顯

9、著高于未妊娠組（228.60±53.21 pg/ml vs.178.90±76.59 pg/ml，P＜0.05）。但是兩組的APP、sAPPα、sAPPβ、Aβ42水平無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.Aβ40低、中、高濃度組的妊娠率分別為16.6％(2/12)、59.2％(16/27)、58.3％(7/12)，Aβ40中、高濃度組的妊娠率顯著高于低濃度組的妊娠率(P＜0.05); Aβ40低、中、高濃度組的取消移植率分別為9％(1/11)

10、、0％(0/27)、9％（1/11），中濃度組的取消移植率顯著低于低濃度和高濃度組的取消移植率(P＜0.05)。
　　3.三組間的兩原核數(shù)、胚胎數(shù)、≤5％碎片的8細(xì)胞胚胎數(shù)、≤5％碎片的8細(xì)胞胚胎數(shù)占總胚胎個數(shù)的比例無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　卵泡液中恰當(dāng)濃度的Aβ40水平可能對IVF臨床結(jié)局有關(guān)，尚未發(fā)現(xiàn)APP、sAPPα、sAPPβ、Aβ42與IVF妊娠結(jié)局有相關(guān)性，由于臨床樣本數(shù)有限，需要擴(kuò)大

11、樣本進(jìn)一步研究。
　　第三部分:Aβ40對體外培養(yǎng)大鼠顆粒細(xì)胞的增殖及甾體激素生成相關(guān)分子的影響
　　目的:
　　研究不同濃度Aβ40對大鼠顆粒細(xì)胞增殖及甾體激素生成過程相關(guān)分子表達(dá)的影響，以探索Aβ40可能通過何種途徑影響卵子發(fā)育。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)21日齡SD雌性大鼠的卵巢顆粒細(xì)胞，分別加入不同濃度(0pg/ml、100 pg/ml、200 pg/ml、300 pg/ml、400 pg/ml)的

12、Aβ40，作用細(xì)胞24小時。用CCK-8檢測不同濃度組的顆粒細(xì)胞增殖狀況。用RT-PCR的方法測定巢顆粒細(xì)胞中甾體激素生成相關(guān)分子FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR的mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.與對照組比較，200、300、400 pg/ml濃度的Aβ40均能促進(jìn)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖（P＜0.05）。200 pg/ml Aβ40對顆粒細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用最強(qiáng)(增殖率114.

13、53％)，其次是300 pg/ml Aβ40（增殖率110.06％），100 pg/ml Aβ40和400 pg/mlAβ40對顆粒細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用最弱（增殖率分別為106.77％和106.86％）。
　　2.與對照組(0pg/ml Aβ40)比較，200 pg/mlAβ40和400 pg/mlAβ40對FSHR、StAR、P450arom基因表達(dá)有促進(jìn)作用（P＜0.05）;200 pg/mlAβ40對IGF-1、P450scc

14、基因表達(dá)有促進(jìn)作用（P＜0.05），但400 pg/mlAβ40對IGF-1、P450scc基因表達(dá)無促進(jìn)作用(P＞0.05);400 pg/mlAβ40對IGF-1R基因表達(dá)有促進(jìn)作用(P＜0.05)，但200pg/mlAβ40對IGF-1R基因表達(dá)無促進(jìn)作用（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.Aβ40可能通過提高顆粒細(xì)胞的增殖能力從而改善了卵子質(zhì)量、有助于獲得臨床妊娠。
　　2.Aβ40可能通過提高顆粒細(xì)胞中F

15、SHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR的基因表達(dá)從而改善了卵子質(zhì)量、有助于獲得臨床妊娠。
　　3.不同濃度的Aβ40對這些分子的調(diào)節(jié)作用不同。過高濃度的Aβ40可能對卵巢顆粒細(xì)胞有負(fù)面作用，提示只有適當(dāng)濃度的Aβ40對顆粒細(xì)胞、卵子、妊娠是有利的。
　　第四部分：體外培養(yǎng)大鼠顆粒細(xì)胞中APP過表達(dá)對甾體激素生成相關(guān)分子的影響
　　目的：
　　探討APP過表達(dá)對卵巢顆粒細(xì)胞甾

16、體激素生成過程相關(guān)分子的影響，以探索APP可能通過何種途徑影響卵泡生長。
　　方法：
　　21日齡SD雌性大鼠腹腔注射孕馬血清50IU/只，48小時收集卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞分為3組:對照組:培養(yǎng)液中不加任何處理因素;空載組:培養(yǎng)液中加入空載質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000; APP過表達(dá)組:培養(yǎng)液中加入APP真核表達(dá)質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000。Western blotting方法檢測APP蛋白表達(dá)變化，檢測轉(zhuǎn)

17、染效率。APP過表達(dá)后，RT-PCR方法檢測甾體激素生成相關(guān)分子FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR及凋亡分子Bax、Bcl2的mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　APP過表達(dá)后:IGF-1的基因表達(dá)明顯受抑制(P＜0.05)，其mRNA水平降至約對照組的四分之一;P450arom和P450scc的基因表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，其mRNA水平上調(diào)至對照組的約15倍;StAR的基

18、因表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，其mRNA水平上調(diào)至對照組的約7倍;IGF-1R和FSHR的基因表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，其mRNA水平約上調(diào)至對照組的約2倍;Bax、Bcl2的基因表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，其mRNA水平約上調(diào)至對照組的約2倍。
　　結(jié)論：
　　APP過表達(dá)可能通過影響顆粒細(xì)胞細(xì)胞中甾體激素生成相關(guān)分子FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR及凋亡Bax、Bc