應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除食管鱗癌EC109細(xì)胞系DMRT2基因及其生物學(xué)功能的初步探究.pdf

1、背景：
　　在我國(guó)，食管癌是高發(fā)的惡性腫瘤之一，病理學(xué)類(lèi)型仍以鱗狀細(xì)胞癌為主。目前雖然在食管癌流行病學(xué)、早期診斷、綜合治療及預(yù)防等方面有了很大的進(jìn)展，但是食管癌的死亡率仍然很高。惡性腫瘤的形成是一個(gè)多階段逐步發(fā)展的過(guò)程，與遺傳學(xué)突變和環(huán)境因素有關(guān)，在內(nèi)源性的突變基因和外源性促癌因素共同驅(qū)動(dòng)下，很多腫瘤細(xì)胞逐漸進(jìn)展為臨床上可見(jiàn)的病理學(xué)形態(tài)。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。通過(guò)我們前期研究，對(duì)10對(duì)食管鱗

2、癌及癌旁正常組織CDNA芯片的47000個(gè)轉(zhuǎn)錄子及變異型表達(dá)情況的比較分析[1]，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)差異性表達(dá)上調(diào)基因：DMRT2、CTTN、MCM10和SCYA26。其中DMRT2基因?qū)儆贒M基因（double-sexandmab-3relatatedtranscriptionfactor）家族，表達(dá)一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是調(diào)控性別的發(fā)育和分化。而有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌及腎透明細(xì)胞癌中[2-4]，該基因表達(dá)缺失。為了推測(cè)DMRT2在

3、食管鱗癌中的生物學(xué)功能作用，本研究將基于食管鱗癌細(xì)胞水平，應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向敲除食管鱗癌細(xì)胞株中DMRT2基因，利用功能實(shí)驗(yàn)探究DMRT2在食管鱗癌中的生物學(xué)作用。
　　目的：
　　本研究擬應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)建立DMRT2敲除食管鱗癌細(xì)胞株，探討DMRT2在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　研究方法：
　?。?）培養(yǎng)5株食管鱗癌細(xì)胞系；利用Westernblot篩選出DMRT2高表

4、達(dá)的細(xì)胞系；
　?。?）在DMRT2exon上設(shè)計(jì)sgRNA及reporter（包含sgRNA序列及熒光標(biāo)記，可用于篩選敲除的陽(yáng)性細(xì)胞）。構(gòu)建重組質(zhì)粒PGL3-U6-sgRNA及pmCherry-EGFP-reporter。酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的連接情況。LIP2000法將上述兩種質(zhì)粒及Cas9質(zhì)粒（為鄭州大學(xué)中英分子實(shí)驗(yàn)室ProfessorDu友情提供）共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞JH293，篩選出內(nèi)源活性sgRNA。另用LIP2000法將EGF

5、P質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞，篩選最佳轉(zhuǎn)染比例。
　　（3）LIP2000法將上述驗(yàn)證具有內(nèi)源活性sgRNA、reporter與Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC109細(xì)胞（DMRT2蛋白高表達(dá)），根據(jù)載體中熒光蛋白表達(dá)情況，熒光顯微鏡下觀(guān)察，最終經(jīng)流式分選，收集單個(gè)細(xì)胞到96孔板，培養(yǎng)單克隆細(xì)胞。
　?。?）提取存活的單克隆細(xì)胞基因組。在sgRNA對(duì)應(yīng)細(xì)胞基因組序列的上下游設(shè)計(jì)引物，pcr出該片段，連接T-SIMPLE，轉(zhuǎn)化大腸桿菌

6、超級(jí)感受態(tài)，搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液送基因測(cè)序，同時(shí)提取單克隆細(xì)胞的蛋白，Westernblot驗(yàn)證DMRT2敲除情況。
　?。?）利用本實(shí)驗(yàn)室IncuCyteZOOM儀器，進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，包括：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等。此外利用流式檢測(cè)分析早期細(xì)胞凋亡比例，最后統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，推測(cè)該基因?qū)?xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響。
　　研究結(jié)果：
　?。?）半定量Westernblot法分析5株食管鱗癌細(xì)胞株中DM

7、RT2蛋白表達(dá)情況，其中高表達(dá)細(xì)胞株：EC109、EC9706、K30、HKESC1，低表達(dá)細(xì)胞株：K510。
　?。?）EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞，得出最佳轉(zhuǎn)染比例為1:4，在DMRT2exon上設(shè)計(jì)處數(shù)個(gè)sgRNA，分別轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞，最終篩選出內(nèi)源活性最好的sgRNA3:accggagctggaagaggacgtctg。將驗(yàn)證內(nèi)源活性的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染EC109,經(jīng)流式分選，培養(yǎng)單克隆細(xì)胞，再通過(guò)基因測(cè)序及Westernbl

8、ot驗(yàn)證，最終得到DMRT2敲除細(xì)胞株1株，部分敲除細(xì)胞株4株。
　?。?）選擇DMRT2敲除的細(xì)胞株EC1091-8（-/-）和敲低細(xì)胞株4-8（+/-）與野生型EC109進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)比較。結(jié)果如下：①細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)EC1091-8（-/-）和4-8（+/-）比野生型EC109細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②劃痕遷移實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察三組的遷移速率，發(fā)現(xiàn)早期野生型EC109較EC1091-8（-/-）和4-8（+/-）遷移速率快，但

9、24h以后EC1091-8（-/-）和4-8（+/-）細(xì)胞遷移速率加快，野生型EC109遷移速率減慢。③侵襲實(shí)驗(yàn)加入Matrigel膠后比較各組侵襲速率，發(fā)現(xiàn)三組遷移速率差異不明顯。④流式檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)先用0.2mmol/L雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡12小時(shí)后，凋亡試劑盒檢測(cè)，流式分析顯示EC1091-8（-/-）和4-8（+/-）細(xì)胞早期凋亡比率多于野生型EC109細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.DMRT2基因參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，并