基于黃單胞菌冰核蛋白N端表面展示體系的建立及初步應(yīng)用研究.pdf

1、本文以野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv．campestris ACCC 10049）為出發(fā)菌株，克隆了具有表面展示活性的冰核蛋白基因（INP，ice nucleaiton protein）的N端（大小為541bp），并與NCBI中登錄的冰核基因進(jìn)行了同源比對(duì)分析，其與黃單胞菌ATCC 39913菌株的冰核基因同源性高達(dá)99％。對(duì)該冰核蛋白N端（inaXY）進(jìn)行了蛋白理化性質(zhì)分析，二級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2、，初步確定該冰核蛋白N端具有錨定蛋白功能。
　　 為了確定所克隆獲得的冰核蛋白N端是否可以作為錨定蛋白用于表面展示，本研究選擇了活性易于檢測(cè)且具有一定應(yīng)用前景的短小芽孢桿菌脂肪酶（Bacillus pumilus YZ02 lipase，bpL）作為乘客蛋白，與載體蛋白INP的N端相融合，構(gòu)建融合基因inαXN-bpL，并克隆于超表達(dá)載體pET28a（+），得到重組質(zhì)粒pETinaXN-bpL，然后轉(zhuǎn)化到宿主菌大腸桿菌（Esch

3、erichia coli）Rosetta 2（DE3）中，獲得具有全細(xì)胞催化活力的重組菌株P(guān)IL3R。進(jìn)一步采用細(xì)胞分級(jí)、脂肪酶活性測(cè)定、InvisionTM His-tag In-gel stain分析和免疫熒光測(cè)定等手段證實(shí)了融合蛋白inaXN-bpL在重組菌細(xì)胞外膜的定位和成功展示。利用分光光度法檢測(cè)重組菌的脂肪酶酶活，以對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯為最適底物，測(cè)定酶活為74.6±4.5 U/mg凍干細(xì)胞，其展示水平推算結(jié)果為每個(gè)細(xì)胞表面展

4、示有19267個(gè)脂肪酶分子；展示后的脂肪酶最適pH比自由酶的明顯提高，由8.5上升到11.0；其在Tris-HCl緩沖液和40℃中溫浴一周后，其酶活仍在80％以上。
　　 本文進(jìn)一步選擇具重金屬吸附特性的猴金屬硫蛋白α結(jié)構(gòu)域四聚體（MT4α）作為乘客蛋白，構(gòu)建inαXN-MT4α融合基因，并利用共生誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子PnifH，構(gòu)建出共生誘導(dǎo)條件下表達(dá)的目標(biāo)重組質(zhì)粒pIM-PnifH。從而為后續(xù)構(gòu)建可用于土壤重金屬污染修復(fù)的重組根瘤