microRNa-126通過IRS-1調(diào)控糖尿病模型鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞周細(xì)胞PI3K-AKT-VEGF通路并抑制細(xì)胞增殖及侵襲作用的研究.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是成年人失明的重要原因之一，隨著人們生活水平的提高，及胰島素替代治療的廣泛應(yīng)用，其發(fā)病率逐年增高。糖尿病視網(wǎng)膜病變分為非增殖型病變和增殖型病變兩種，后者以新生血管形成為主要病理特點(diǎn)，易導(dǎo)致玻璃體出血、增殖性視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重并發(fā)癥，是造成嚴(yán)重視功能損害的主要原因。新生血管的生長受血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的調(diào)節(jié)，新生血管生成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。VEGF是一種血管內(nèi)

2、皮細(xì)胞特異性的分裂原，能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管形成。在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者眼內(nèi)VEGF含量明顯上調(diào)，且其上調(diào)程度與視網(wǎng)膜血管出血、滲出等病理過程相關(guān)。VEGF的過度表達(dá)為糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的重要機(jī)制之一。因此，抑制VEGF的表達(dá)成為臨床上糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的重要思路。
　　微小核糖核酸（MicroRNA，miRNAs）是近年來在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的并具有調(diào)控功能的非編碼RNA，miRNAs可通過序列特異性的

3、方式與特定靶基因的3'UTR相互作用從而調(diào)節(jié)靶基因的蛋白表達(dá)。miRNAs的功能十分廣泛，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性，對細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、生長發(fā)育、胰島素分泌、腫瘤發(fā)生、器官形成、造血過程、病毒等微生物感染防御等均具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，某些miRNA具有調(diào)節(jié)新生血管形成的作用，其中miR-126是目前報(bào)道的與血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管功能密切相關(guān)的一種miRNA，也是體內(nèi)對維持血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管完整性至關(guān)重要的一種血

4、管生成信號調(diào)節(jié)因子。據(jù)報(bào)道，miR-126可負(fù)性調(diào)控VEGF等血管生長因子，并抑制新生血管的生成。在多種腫瘤細(xì)胞中，miR-126的表達(dá)均較正常細(xì)胞降低，因此miR-126曾被視為一種抑制細(xì)胞生長的因素，且作用于胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)。IRS-1在胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。有報(bào)道視網(wǎng)膜表達(dá)大量的IRS-1和PI3K，且胰島素通過IRS-1/

5、PI3K/AKT通路和RAS/MAPK通路可誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄和VEGF的表達(dá)。胰島素對血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的上調(diào)可能是通過激活PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)的，且據(jù)KEGG通路數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，VEGF位于IRS-1/ PI3K/AKT通路的下游。因此，在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，miR-126很可能作用于IRS-1且通過IRS-1/PI3K/AKT通路參與視網(wǎng)膜新生血管形成過程的調(diào)節(jié)。
　　目的:檢測miR

6、-126及IRS-1在糖尿病模型大鼠的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)和周細(xì)胞(retinal pericytes，RP)中的表達(dá)水平，尋找并證實(shí)IRS-1為miR-126的靶基因。探討過表達(dá)或抑制miR-126對糖尿病模型鼠的EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中IRS-1及VEGF、PI3K、AKT等通路蛋白表達(dá)水平的影響;探討過表達(dá)或抑制miR-126對糖尿病模型鼠的EC細(xì)胞和RP細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。驗(yàn)證miR-

7、126對糖尿病模型鼠EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中IRS-1及VEGF、PI3K、AKT等蛋白表達(dá)水平的抑制作用以及對EC細(xì)胞和RP細(xì)胞增殖及侵襲能力的抑制作用是否是通過調(diào)控IRS-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。為miR-126成為一種潛在的以IRS-1為靶點(diǎn)治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的新藥提供理論依據(jù)。
　　方法:通過real-time PCR檢測miR-126及IRS-1在糖尿病模型鼠EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平。通過Western blot檢

8、測IRS-1的蛋白表達(dá)水平。通過向糖尿病模型鼠EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染人工合成的miR-126類似物或miR-126抑制劑來過表達(dá)miR-126或抑制內(nèi)源性miR-126的表達(dá)，并通過real-timePCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-126的mRNA水平，以驗(yàn)證miR-126類似物及miR-126抑制劑調(diào)節(jié)細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平的有效性和效率。用生物信息學(xué)檢索軟件TrgetScan分析預(yù)測miR-126的靶基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基

9、因檢測系統(tǒng)檢測miR-126對IRS-1的調(diào)控作用。先將含有預(yù)測的miR-126結(jié)合位點(diǎn)的IRS-1基因3'UTR DNA片段克隆入pGL-3-promotor質(zhì)粒中，構(gòu)建報(bào)告基因質(zhì)粒。然后將含有野生型或突變型IRS-13'UTR的熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒(pMIR-REPORT-IRS-1 wt和pMIR-REPORT-IRS-1 mut)與miR-126類似物或其對照共轉(zhuǎn)染EC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。同時(shí)用We

10、stern blot的方法檢測轉(zhuǎn)染了miR-126類似物或miR-126抑制劑后，糖尿病模型鼠EC細(xì)胞及RP細(xì)胞中IRS-1的蛋白表達(dá)水平。用MTT法檢測轉(zhuǎn)染了miR-126類似物或miR-126抑制劑后，糖尿病模型鼠EC細(xì)胞及RP細(xì)胞的增殖率。用Transwell小室檢測轉(zhuǎn)染了miR-126類似物或miR-126抑制劑后，糖尿病模型鼠EC細(xì)胞及RP細(xì)胞的侵襲能力。通過Western blot的方法檢測過表達(dá)或抑制miR-126表達(dá)時(shí)，

11、糖尿病模型鼠EC細(xì)胞中PI3K/AKT通路相關(guān)分子PI3K、AKT以及VEGF的蛋白表達(dá)水平。最后通過siRNA干擾糖尿病模型鼠EC細(xì)胞的IRS-1基因表達(dá)，并用Western blot的方法檢測IRS-1基因沉默狀態(tài)下，抑制miR-126內(nèi)源性表達(dá)后，視網(wǎng)膜EC細(xì)胞中PI3K、AKT以及VEGF等蛋白的表達(dá)水平，并分別用MTT法和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測上述條件下糖尿病模型鼠EC細(xì)胞和RP細(xì)胞的增殖和侵襲能力。
　　結(jié)果:

12、real-time PCR的檢測結(jié)果顯示糖尿病模型鼠的EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平較正常對照降低。轉(zhuǎn)染miR-126類似物或miR-126抑制劑可有效地在糖尿病模型鼠EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中過表達(dá)miR-126或抑制其內(nèi)源性miR-126的表達(dá)水平。生物信息學(xué)預(yù)測IRS-1基因?yàn)樘悄虿∧Ｐ虴C細(xì)胞和RP細(xì)胞中miR-126的靶基因。在糖尿病模型鼠的EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中，IRS-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均較正常對照升高。通過共

13、轉(zhuǎn)染miR-126類似物或抑制劑與含有IRS-13'UTR的熒光素酶報(bào)告載體并采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測，以及通過轉(zhuǎn)染miR-126類似物或抑制物來過表達(dá)或抑制miR-126表達(dá)，Western blot的方法檢測IRS-1的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-126可顯著下調(diào)IRS-1的表達(dá)水平，而抑制miR-126的表達(dá)可上調(diào)IRS-1的表達(dá)水平。
　　EC細(xì)胞和RP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染了miR-126類似物或miR-126抑制劑及其對照

14、后，用MTT的方法檢測了細(xì)胞的增殖率，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-126使EC細(xì)胞和RP細(xì)胞的增殖率較對照組降低，而抑制miR-126則使EC細(xì)胞和RP細(xì)胞的增殖率較對照組增加，提示miR-126可抑制糖尿病模型鼠EC細(xì)胞和RP細(xì)胞的增殖能力。同時(shí)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后EC細(xì)胞和RP細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，通過miR-126類似物轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-126，使侵襲細(xì)胞的數(shù)量較對照組顯著減少，而經(jīng)miR-126抑制劑轉(zhuǎn)染抑制m

15、iR-126內(nèi)源性表達(dá)后，侵襲細(xì)胞的數(shù)量較對照組顯著增多，提示miR-126可抑制糖尿病模型鼠EC細(xì)胞和RP細(xì)胞的侵襲能力。
　　進(jìn)而，通過Western blot的方法檢測了通過轉(zhuǎn)染miR-126類似物或miR-126抑制劑過表達(dá)或抑制miR-126表達(dá)后，PI3K/AKT通路相關(guān)分子PI3K、AKT以及VEGF的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-126可顯著下調(diào)PI3K，AKT以及VEGF蛋白的表達(dá)，而抑制miR-126則

16、可顯著上調(diào)PI3K，AKT以及VEGF蛋白的表達(dá)。為了證實(shí)miR-126對PI3K、AKT及VEGF等PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)及對視網(wǎng)膜EC細(xì)胞和RP細(xì)胞增殖及侵襲能力的抑制作用是通過調(diào)控IRS-1基因而實(shí)現(xiàn)的，用siRNA干擾IRS-1的表達(dá)，將IRS-1-siRNA與miR-126抑制劑或其對照共轉(zhuǎn)染糖尿病模型鼠EC細(xì)胞，并用Western blot的方法檢測共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的PI3K、AKT及VEGF等蛋白表達(dá)水平，用M

17、TT法及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力。結(jié)果表明，IRS-1被干擾后，miR-126抑制劑對糖尿病模型鼠EC細(xì)胞的PI3K、AKT及VEGF等蛋白表達(dá)水平以及對視網(wǎng)膜EC細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的作用均被削弱。
　　結(jié)論:本課題發(fā)現(xiàn)了miR-126在糖尿病模型鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中表達(dá)下降。miR-126在糖尿病模型鼠EC細(xì)胞和RP細(xì)胞中的靶基因?yàn)镮RS-1。過表達(dá)miR-126可通

18、過下調(diào)其靶基因IRS-1的表達(dá)水平而下調(diào)VEGF、PI3K、AKT等通路蛋白的表達(dá)水平，且抑制視網(wǎng)膜EC細(xì)胞和RP細(xì)胞的增殖能力及侵襲能力。通過siRNA干擾IRS-1的表達(dá)，可抵消miR-126抑制劑對上述通路蛋白表達(dá)的EC細(xì)胞增殖及侵襲能力的作用。我們的結(jié)果表明，IRS-1是miR-126的靶基因，miR-126通過調(diào)控IRS-1參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理生理過程。本研究的結(jié)果有助于我們進(jìn)一步理解糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制，為miR