UC-iPSC向NSC分化體系的比較及NSC在HIE模型中的初步研究.pdf

1、目的：
　　比較抑制劑濃度及誘導(dǎo)初始密度的不同對(duì)尿液細(xì)胞重編程所得誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（urine cells derived induced pluripotentstem cells，UC-iPSC）向神經(jīng)干細(xì)胞分化效率及神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells,NSC）生存狀態(tài)的影響，從而確定一種較穩(wěn)定、高效的誘導(dǎo)分化的方法；檢測(cè) UC-iPSC源性神經(jīng)干細(xì)胞在新生大鼠缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic en

2、cephalopathy,HIE)動(dòng)物模型腦內(nèi)的生存、遷移及分化能力。
　　方法：
　　比較不同誘導(dǎo)體系誘導(dǎo) UC-iPSC向神經(jīng)干細(xì)胞分化的效率及神經(jīng)干細(xì)胞生存狀態(tài)的影響：A體系：SB431542和Drosomophorin的濃度均為5 um/ml,誘導(dǎo)初始密度為100％， B體系：SB431542的濃度為5um/ml, Drosomophorin的濃度為1um/ml,誘導(dǎo)初始密度為30-50%。通過(guò)觀察誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細(xì)

3、胞的形態(tài)學(xué)變化；q-PCR比較神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)基因Pax6，Nestin,Sox1,Sox2的表達(dá)量及流式細(xì)胞術(shù)比較誘導(dǎo)第16天Pax6的陽(yáng)性率等方法比較兩種體系的誘導(dǎo)效率。建立HI E模型：取出生7天的SD大鼠，行左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎、離斷手術(shù)，繼而在8% O2，92% N238℃條件下缺氧120mins，建立HIE的疾病動(dòng)物模型。造模后第7天，TTC染色觀察大腦損傷灶。神經(jīng)干細(xì)胞移植：動(dòng)物模型建立后第3天，取已鑒定的UC-iPSC源性神經(jīng)

4、干細(xì)胞3μL、1×105移植入疾病模型鼠側(cè)腦室內(nèi)。分別于第7、28天，心臟灌流取腦、固定、切片、免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡觀察分析外源性神經(jīng)干細(xì)胞在模型動(dòng)物腦內(nèi)的生存、遷移及分化的情況。
　　結(jié)果：
　　A體系獲得的第1代神經(jīng)干細(xì)胞，呈明亮的圓球形，聚集緊密；B體系獲得的第1代神經(jīng)干細(xì)胞，則呈灰暗的不規(guī)則形，聚集松散。q-PCR顯示A體系誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞神經(jīng)干相關(guān)基因的表達(dá)量高于 B體系。流式細(xì)胞術(shù)分析誘導(dǎo)第3代神經(jīng)干細(xì)胞

5、高表達(dá)Pax6,Nestin,Sox1,Sox2等神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)基因。自發(fā)分化第20天，形成明顯的神經(jīng)纖維束，免疫熒光證明該細(xì)胞高表達(dá)TUJ-1，MAP2等神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物及部分細(xì)胞表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物GFAP。TTC染色顯示建模后第7天在腦皮質(zhì)、紋狀體及海馬部位存在明顯的白色損傷區(qū)域。UC-iPSC源性神經(jīng)干細(xì)胞移植后第7天，免疫熒光染色可在左側(cè)腦室內(nèi)及室管壁檢測(cè)到Nestin與Stem121雙陽(yáng)性細(xì)胞，即移植的神經(jīng)干細(xì)