大鼠胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化及在動(dòng)物模型中移植的研究.pdf

1、背景介紹：
　　視網(wǎng)膜變性疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性（Age-related macular degeneration，AMD）是主要的致盲性眼病，目前臨床上尚缺乏有效的治療措施。細(xì)胞移植治療為這類疾病的患者帶來了希望。胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESC）是細(xì)胞治療重要的供體細(xì)胞來源。在本研究中，我們用大鼠ESC（rESC）分化得到了視網(wǎng)膜祖細(xì)胞（Retina progenitor cell,RPC），并通過

2、移植檢測(cè)了其對(duì)患有視網(wǎng)膜變性疾病大鼠的治療作用。
　　方法：
　　本課題首先通過無血清懸浮快速沉降形成類胚體（quickly aggregated serum free embryonic body，SFEBq）的方法將rESC誘導(dǎo)分化為能夠向視網(wǎng)膜方向分化的神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)（第8天）。并通過RT-PCR、冰凍切片、全組織染色，報(bào)告基因檢測(cè)等方法對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定。分化第8天，開始從神經(jīng)上皮向視網(wǎng)膜方向的誘導(dǎo)分化。我們采用了兩

3、種方法。方法一：分化第8天，在含有血清培養(yǎng)的條件下繼續(xù)懸浮培養(yǎng)到第10天。然后，消化類胚體為單細(xì)胞后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，到第16天收樣檢測(cè)，記為rESC-RPC1；方法二：分化第8天，類胚體在含有血清的條件下培養(yǎng)到第14天，然后消化成單細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，第16天收樣檢測(cè)，記為rESC-RPC2。我們對(duì)兩種分化方案獲得的細(xì)胞進(jìn)行了RTqPCR、免疫熒光染色、流式細(xì)胞檢測(cè)以及全基因組表達(dá)譜檢測(cè)鑒定。最后，我們將rESC分化得到的RPC移植到出生后

4、21天的RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔，并在移植后2周、4周和6周通過視網(wǎng)膜電生理（Electroretinogram，ERG）檢測(cè)了視功能。并通過冰凍切片免疫熒光染色檢測(cè)了供體細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的分化和整合情況以及供體細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜外核層厚度的恢復(fù)作用。
　　結(jié)果：
　　在本研究中，我們將rESC體外分化得到了兩種rESC-RPC細(xì)胞，它們都能表達(dá)神經(jīng)祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞的標(biāo)志物，是神經(jīng)祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜各種細(xì)胞的混合群體。rESC-RPC1中

5、膠質(zhì)細(xì)胞含量較高，而rESC-RPC2中神經(jīng)元較多。通過移植發(fā)現(xiàn)它們都能在移植后早期保護(hù)RCS大鼠視網(wǎng)膜功能。rESC-RPC2對(duì)RCS視網(wǎng)膜功能的改善更為明顯，并能夠遷移整合到視網(wǎng)膜中，保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　我們建立了兩種rESC向視網(wǎng)膜方向分化的方法。通過分化得到的含有神經(jīng)元較多的rESC-RPC2能夠保護(hù)遺傳性視網(wǎng)膜變性大鼠模型的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能，具有一定的治療作用。這些工作為推動(dòng) rESC的研究和應(yīng)用做出