電刺激迷走神經(jīng)對(duì)急性腦缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　目前急性腦卒中已成為中國(guó)人致死性疾病的首位原因，及時(shí)恢復(fù)半暗帶腦血流是最直接有效的治療方式。但早期腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）后容易誘導(dǎo)產(chǎn)生大量氧自由基、瀑布式炎癥反應(yīng)、壞死和凋亡等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，多種因素間互相作用，造成二次腦損傷。因此，成功發(fā)展作用于腦卒中多種分子機(jī)制的治療方式是迫切需要的。1997年美國(guó)食品和藥品監(jiān)督局（Food and Drug Administration，

2、FDA）推薦VNS（vagus nerve stimulation,VNS）應(yīng)用于部分發(fā)作性難治性癲癇患者，隨后多個(gè)國(guó)家相繼批準(zhǔn)。近年來(lái)，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)VNS對(duì)急性腦缺血再灌注大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其機(jī)制不明確。本研究擬通過(guò)VNS對(duì)急性腦缺血再灌注后氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥反應(yīng)的影響及可能分子機(jī)制進(jìn)行深入探討，為其臨床應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分：采用顱內(nèi)注射antagmiR210抑制內(nèi)源性miR210表達(dá)，

3、線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞/再灌注(Middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)模型，梗塞30min后給予VNS干預(yù)。MCAO手術(shù)及電刺激過(guò)程監(jiān)測(cè)心率、尾動(dòng)脈血壓、血?dú)庖约坝覀?cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)腦血流變化。再灌注24h時(shí)，熒光定量PCR檢測(cè)各組miR210表達(dá)。采用Bederson5分制評(píng)估再灌注24h時(shí)神經(jīng)體征損傷、測(cè)定腦梗死體積；（Tdt-mediated dutp ni

4、ck end labeling,TUNEL)原位凋亡檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)缺血側(cè)皮層神經(jīng)元凋亡數(shù)量；ELISA檢測(cè)缺血側(cè)腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)水平（Superoxide Dismutase，SOD）、（Maleic Dialdehyde assay，MDA）、（Glutathione，GSH)。Western blot技術(shù)檢測(cè)各組缺血側(cè)皮層p-Akt和caspase-3活性蛋白表達(dá)情況，免疫熒光染色測(cè)各組缺血皮層caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。

5、>　　第二部分：采用顱內(nèi)注射PPARγRNAi技術(shù)抑制PPARγ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）表達(dá)，構(gòu)建右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞/再灌注模型，梗塞30min后VNS干預(yù)，熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)各組缺血側(cè)皮層PPARγ基因和蛋白表達(dá)；采用Ludmila Belayev12分制評(píng)估神經(jīng)功能缺失和腦梗死體積；HE染色顯示各組缺血側(cè)腦組織的病理變化；免疫

6、熒光雙標(biāo)檢測(cè)缺血側(cè)皮層小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面a7乙酰膽堿能受體（a7 nicotinic acetylcholine receptor，a7nAchR）表達(dá)；ELISA檢測(cè)缺血側(cè)腦組織腫瘤壞死因子a（Tumor necrosis factorα，TNF-a）、白介素-1β（Interleukin1β，IL-1β）含量水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分：
　?。?）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，VNS對(duì)大鼠心率（Heart rate，

7、HR）、血壓（Blood pressure，BP）、血?dú)饧坝覀?cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)腦血流無(wú)明顯影響（p＞0.05）；
　?。?）與缺血組（I/R）相比，VNS進(jìn)一步增加缺血誘導(dǎo)的miR210表達(dá)（p＜0.05），改善腦缺血再灌注急性期神經(jīng)功能癥狀缺失和減少腦梗死體積，減少缺血側(cè)皮層神經(jīng)元凋亡數(shù)量（p＜0.05），沉默miR210后，進(jìn)一步加重缺血導(dǎo)致的腦組織損傷同時(shí)也減少VNS神經(jīng)保護(hù)作用（p＜0.05），提示miR210參與VNS的

8、神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。
　　(3）與假手術(shù)組（sham I/R）相比，缺血后導(dǎo)致大鼠缺血側(cè)皮層SOD活性下降、GSH含量減少和MAD含量增加；與缺血組（I/R）相比,VNS明顯抑制缺血側(cè)腦組織氧化應(yīng)激水平（p＜0.05）；沉默miR210后，進(jìn)一步加重再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)（p＜0.05），同時(shí)削弱VNS抗氧化應(yīng)激效應(yīng)（p＜0.05）。
　?。?）與假手術(shù)組（sham I/R）相比，缺血再灌注后缺血側(cè)腦組織p-Akt含量減少（p＜

9、0.05），VNS干預(yù)后逆轉(zhuǎn)缺血抑制p-Akt表達(dá)的效應(yīng)（p＜0.05），并且p-Akt蛋白變化與antagomiR210干擾無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性（p＞0.05）。
　?。?）與假手術(shù)組（sham I/R）相比，缺血組（I/R）缺血側(cè)皮層caspase3活性蛋白表達(dá)明顯增加（p＜0.05）；沉默miR210后，進(jìn)一步增加缺血側(cè)腦組織caspase3活性（p＜0.05），而VNS后可抑制缺血側(cè)皮層caspase3活性蛋白表達(dá)（p＜0.05）

10、；沉默miR210后，明顯減弱VNS抑制凋亡反應(yīng)效應(yīng)（p＜0.05），各組免疫熒光caspase3活性細(xì)胞變化趨勢(shì)同蛋白表達(dá)基本一致，提示miR210參與VNS對(duì)氧化應(yīng)激和凋亡的調(diào)控過(guò)程。
　　第二部分：
　?。?）熒光定量PCR和Western blot法檢測(cè)顱內(nèi)注射PPARγRNAi干預(yù)后各組PPARγ表達(dá)示：與缺血+陰性病毒對(duì)照組（I/R＋LV-control）相比，缺血+電刺激+陰性病毒對(duì)照組（I/R+VNS+LV-

11、control）中PPARγ基因和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（p＜0.05）；PPARγRNAi干擾后，缺血＋干擾組（I/R+LV-shPPARr)和缺血+電刺激+干擾組（I/R+VNS+LV-shPPARr）兩組基因蛋白表達(dá)明顯下降（p＜0.05）。
　?。?）再灌注24h時(shí)，VNS改善神經(jīng)功能癥狀缺失，減少腦梗死體積，減輕腦組織病理?yè)p傷，抑制缺血側(cè)皮層炎癥因子（TNF-a、IL-1β）水平（p＜0.05）；PPARγRNAi干擾后，VN

12、S保護(hù)效應(yīng)明顯下降，炎癥因子水平增加（p＜0.05），提示PPARγ參與VNS對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制過(guò)程。
　?。?)免疫熒光顯示VNS同時(shí)可以激活缺血側(cè)皮層小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表面a7nAchR，調(diào)控神經(jīng)免疫細(xì)胞形態(tài)和功能，發(fā)揮抗炎作用。
　　結(jié)論:
　?。?）VNS改善急性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能癥狀缺失和減少腦梗死體積。
　　（2）VNS減少急性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡數(shù)量。
　　（3）VN