腫瘤微環(huán)境促進骨髓播散腫瘤細胞(DTCs)形成的機制研究.pdf

1、目的:揭示腫瘤微環(huán)境啟動前列腺癌細胞發(fā)生EMT并形成DTCs的分子機制，對該過程進行阻斷，以減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　方法:運用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定表達luciferase的前列腺癌細胞系(PC3-luc，C4-2B-luc，RM-1-luc)，并以皮下接種的方式建立小鼠前列腺癌模型，待腫瘤長到一定大小時，將皮下腫瘤取出再培養(yǎng)并運用Westernblot檢測EMT標(biāo)記蛋白的變化;運用RT-PCR檢測皮下接種前列腺癌小鼠的DTC細

2、胞;對親本前列腺癌細胞及小鼠皮下前列腺癌細胞進行生物學(xué)特點的比較，并探索其分子機制;此外本研究還建立了前列腺癌細胞心內(nèi)注射和脛骨注射轉(zhuǎn)移模型，并分離培養(yǎng)了特異性肺轉(zhuǎn)移前列腺癌細胞。
　　結(jié)果:本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達luciferase的前列腺癌細胞系，建立了小鼠皮下前列腺癌接種模型，檢測到了小鼠骨髓中存在DTC細胞，且皮下腫瘤再培養(yǎng)的細胞發(fā)生了EMT改變，并獲得了更強的增殖、遷移侵襲及血管再生能力。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)其可能是由于A

3、kt調(diào)控MCP-1的表達來實現(xiàn)，或經(jīng)Akt/AMPKα/mTOR信號通路調(diào)控所致。此外本研究建立的心內(nèi)注射小鼠模型和脛骨注射小鼠模型均發(fā)生了全身多臟器的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:接種于小鼠皮下的前列腺癌細胞在體內(nèi)微環(huán)境的作用下，發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化并促進了DTCs的產(chǎn)生，且其獲得了更強的增殖、遷移侵襲和血管形成能力。這可能是由于Akt調(diào)控MCP-1高表達或Akt/AMPKα/mTOR信號通路調(diào)控所致。心內(nèi)注射及脛骨注射腫瘤模型可用于器官特異性

4、轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究。
　　第一部分 建立穩(wěn)定表達luciferase的前列腺癌細胞系
　　目的:構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達luciferase的前列腺癌細胞系。
　　方法:對pCDNA3.1、pGL3-control、pGL4.50及包裝質(zhì)粒VSV-G、pRRE、RSV-REV進行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及擴增提取;對pCDNA3.1，pGL3-control脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，pGL4.50脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，pGL4.50電穿孔轉(zhuǎn)染法，pGLV4-EF1a

5、-Luc慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定表達luciferase前列腺癌細胞株進行比較。根據(jù)GFP的表達量，運用流式細胞分選術(shù)收集高表達GFP的pGLV4-EF1a-Luc慢病毒轉(zhuǎn)染的PC3-luc和C4-2B-luc細胞;構(gòu)建luciferase慢病毒載體，運用菌液PCR，質(zhì)粒電泳純化雙酶切及質(zhì)粒測序等方法鑒定連接正確的慢病毒載體，運用VSV-G、pRRE、RSV-REV三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)在293T細胞中進行病毒包裝并轉(zhuǎn)染多種細胞株，Blastici

6、din抗生素進行陽性篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達luciferase的前列腺癌細胞株以及其他種類的細胞株。
　　結(jié)果:在對多種轉(zhuǎn)染方法比較之后，本研究最終選用購自上海吉瑪公司的pGLV4-EF1a-Luc慢病毒液構(gòu)建了穩(wěn)定表達luciferase的PC3和C4-2B兩株前列腺癌細胞系PC3-luc和C4-2B-luc，并運用流式細胞儀分選出了GFP強陽性的細胞。另外本研究自行構(gòu)建了luciferase慢病毒載體，挑選出菌液PCR、雙酶切、測序

7、等方法驗證正確的載體進行擴增和包裝，構(gòu)建了穩(wěn)定表達luciferase的小鼠RM-1前列腺癌細胞株RM-1－luc以及其他種類的前列腺癌細胞株，肝癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌及部分耐藥株等在內(nèi)的熒光素酶標(biāo)記細胞，以供實驗室其他研究所用。
　　結(jié)論:與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法及電穿孔轉(zhuǎn)染法相比，慢病毒轉(zhuǎn)染法更適于構(gòu)建穩(wěn)定表達目的基因的細胞株。
　　第二部分 建立前列腺癌細胞體內(nèi)發(fā)生EMT的研究模型
　　目的:建立PC3-luc， C4-

8、2B-luc，RM-1-luc小鼠皮下接種腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的早期事件。
　　方法:將PC3-luc細胞接種于裸鼠皮下，C4-2B-luc細胞接種于SCID小鼠皮下和RM-1-luc細胞接種于C57BL/6J小鼠皮下（2×106 cells/只）;接種后每周一次活體成像，每周2次游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積并監(jiān)測小鼠體重變化，實時動態(tài)觀察腫瘤生長;待腫瘤長到一定大小時，將小鼠處死，取皮下腫瘤進行體外再培養(yǎng)(PC3-luc s1，C4-

9、2B-luc s1，RM-1-luc s1)，觀察皮下腫瘤細胞的形態(tài)改變并運用WB檢測與親本細胞相比，皮下腫瘤再培養(yǎng)細胞EMT標(biāo)志蛋白的改變。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了PC3-luc，C4-2B-luc，RM-1-luc皮下接種腫瘤模型并獲得了皮下腫瘤生長曲線;皮下腫瘤再培養(yǎng)細胞與親本細胞相比，形態(tài)發(fā)生了改變。EMT標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)在與親本細胞相比，Vimentin和snail在PC3-luc s1細胞中的表達增高，而E-cadherin

10、，claudin-1和ZO-1在PC3-lucs1細胞中的表達下降。
　　結(jié)論:皮下腫瘤細胞發(fā)生了EMT改變。
　　第三部分 骨髓播散腫瘤細胞的檢測
　　目的:檢測皮下接種腫瘤細胞小鼠模型骨髓中是否存在DTC細胞
　　方法:接種了腫瘤細胞的小鼠待皮下腫瘤長到一定大小時，將小鼠處死，分離髂骨、股骨和脛骨（髂骨和股骨用于分離骨髓，脛骨用于固定脫鈣包埋），髂骨和股骨沖出骨髓后分別提取總RNA用于PCR檢測。PC3-Tx

11、R，DU145，CNE2小鼠骨髓來自于本實驗室其他課題組的皮下腫瘤細胞接種模型?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄后檢測Luc2和Human GAPDH基因在小鼠骨髓mRNA水平的表達情況，小鼠GAPDH作為內(nèi)參;脛骨置于10％中性福爾馬林中固定24小時后，轉(zhuǎn)入10％EDTA脫鈣完全后轉(zhuǎn)移至70％乙醇保存并進行石蠟包埋和切片。
　　結(jié)果:PCR結(jié)果顯示在這些腫瘤細胞接種的小鼠骨髓中有Luc2和HumanGAPDH的表達，而他們在正常對照小鼠的骨髓中沒

12、有表達。
　　結(jié)論:皮下接種了腫瘤細胞的小鼠骨髓中出現(xiàn)了DTCs。
　　第四部分 腫瘤微環(huán)境促進前列腺癌細胞生物學(xué)功能的改變
　　目的:檢測EMT發(fā)生后，獲得了間充質(zhì)表型的PC3-luc s1細胞的生物學(xué)特性改變。
　　方法:將PC3，PC3-luc和PC3-luc s1細胞分別再次注射于裸鼠皮下2×106cells/只），每周進行一次活體成像，每周兩次游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小及體重監(jiān)測，比較兩株細胞在腫瘤生長過程中

13、所發(fā)生的變化。待腫瘤生長到一定大小時，將小鼠處死，分離皮下腫瘤，比較組織改變;用MTS法體外比較PC3， PC3-luc和PC3-luc s1的細胞增殖情況;運用細胞劃痕愈合實驗及Transwell小室比較PC3，PC3-luc和PC3-luc s1三株細胞的遷移和侵襲能力。
　　結(jié)果:在體內(nèi)，PC3-luc s1小鼠皮下腫瘤比PC3和PC3-luc小鼠皮下腫瘤生長速度快，均勻且表面布有更豐富的血管;體外實驗證實與PC3及PC3-

14、luc細胞相比，PC3-luc s1細胞增殖速度并未增加，遷移和侵襲能力均有增強。
　　結(jié)論:與PC3和PC3-luc相比，發(fā)生了EMT改變后的PC3-luc s1具有了更強的增殖，遷移侵襲和血管生成能力。
　　第五部分 微環(huán)境誘導(dǎo)前列腺癌細胞發(fā)生EMT并形成DTCs的作用機制
　　目的:揭示前列腺癌細胞在體內(nèi)生長過程中發(fā)生EMT并產(chǎn)生DTCs的分子機制。
　　方法:運用antibody array，Protei

15、n/DNA array檢測PC3，PC3-luc，PC3-lucs1，C4-2B，C4-2B-luc，C4-2B-luc s1細胞的差異條件培養(yǎng)上清蛋白表達和核蛋白差異表達轉(zhuǎn)錄因子;運用STRING10.0軟件分析其可能的相關(guān)通路;通過ELISA和熒光定量RT-PCR驗證其差異表達蛋白在PC3，PC3-luc，PC3-luc s1中的表達，Westem blot驗證核差異表達轉(zhuǎn)錄因子，并檢測相關(guān)重要通路蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:

16、與親本細胞相比，MCP-1在PC3-luc s1和C4-2B-luc s1條件培養(yǎng)上清中的表達均有增高;在PC3-luc s1細胞核中，轉(zhuǎn)錄因子c-Myb，SP-1表達下調(diào)，c-Jun表達上調(diào)，而CREB變化不大?？偟鞍譝estern blot檢測結(jié)果顯示:p-Akt，Akt，p-AMPKα，AMPKα，p-mTOR，mTOR，p-p70S6K，p70S6K， p-4E-BP1，4E-BP1蛋白在PC3，PC3-luc，PC3-luc