腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液微環(huán)境促肺癌機(jī)制和藥物治療.pdf

1、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展必須有充足的營養(yǎng)供給，一般認(rèn)為腫瘤的營養(yǎng)供給依賴于新生血管形成。然而，眾所周知腫瘤新生血管具有畸形高通透性的特點(diǎn)，這種畸形新生血管很難完成充足的營養(yǎng)供給，臨床上抗新生血管形成“餓死”腫瘤的療法不僅沒有達(dá)到預(yù)期的效果，甚至使腫瘤更加惡化的現(xiàn)象也證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。相反，腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液因含有豐富的營養(yǎng)和細(xì)胞生長因子，恰好能夠沐浴和支持腫瘤細(xì)胞生長，有可能是腫瘤發(fā)展的直接和主要營養(yǎng)來源，因此對腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液促癌作用的認(rèn)識是腫瘤防治

2、成功的關(guān)鍵。本研究以肺癌為研究對象探索腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液微環(huán)境促進(jìn)肺癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制以及相關(guān)的藥物治療，以期為肺癌防治提供有效的措施和方法。
　　本研究首先從腫瘤組織中分離腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液并進(jìn)行蛋白定量得到10μg蛋白質(zhì)/毫升的腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液用于體內(nèi)和體外試驗(yàn)。體外試驗(yàn)我們用腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液處理 LLC細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nanog和PCNA的表達(dá)，軟瓊脂克隆形成和細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測腫瘤細(xì)胞自我更新，MTT法檢

3、測腫瘤細(xì)胞增殖，免疫熒光技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞遷移，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞侵襲，AO/EB熒光雙染法檢測腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡。接著，我們采用氣管滴注方式建立了小鼠原位肺癌共移植模型，通過免疫組化和Western Blot檢測肺癌小鼠肺組織中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog，細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA，細(xì)胞水運(yùn)載標(biāo)志物水通道蛋白1，新生血管形成標(biāo)志物CD31，低氧標(biāo)志物低氧誘導(dǎo)因子HIF-1和碳酸酐酶IX，

4、及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物N-cadherin、E-cadherin、Vimentin和Cytokeratin18表達(dá)；同時(shí)，用伊文斯蘭通透性和干濕重法檢測肺癌小鼠肺組織血管通透性和肺組織含水量；用 ELISA試劑盒檢測肺癌小鼠血清中血管紊亂標(biāo)志物5-HIAA，糖酵解標(biāo)志物 ROS、Lactate和Pyruvate，炎癥標(biāo)志物8-OHdG、TNF-α和hs-CRR。另外，我們用新生血管形成抑制劑Vadimezan、抗炎藥物地塞米松、Na-K-

5、ATP酶抑制劑地高辛、以及醛固酮受體阻斷劑螺內(nèi)酯治療腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液共移植肺癌小鼠，觀察其對腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液形成、新生血管形成、血管通透性及腫瘤生長的影響。體外試驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液處理后的LLC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Nanog和PCNA的表達(dá)增加，腫瘤細(xì)胞軟瓊脂克隆和細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)的克隆數(shù)增多，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增加，饑餓誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡減少。小鼠原位癌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液與腫瘤細(xì)胞共移植后小鼠肺癌發(fā)生率升高，肺部

6、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)增多，肺組織血管通透性增強(qiáng)，肺組織含水量增加；肺組織腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog，細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA，細(xì)胞水運(yùn)載標(biāo)志物水通道蛋白1，低氧標(biāo)志物低氧誘導(dǎo)因子 HIF-1和碳酸酐酶IX，及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高，E-cadherin和Cytokeratin18表達(dá)降低；炎癥標(biāo)志物、糖酵解標(biāo)志物和氧化損傷標(biāo)志物水平升高；新生血管形成標(biāo)志物 CD31的表達(dá)沒有顯著變化。有趣的是，炎癥反應(yīng)抑制

7、劑地塞米松、Na-K-ATP酶抑制劑地高辛和醛固酮受體阻斷劑螺內(nèi)酯能夠降低腫瘤細(xì)胞間質(zhì)液誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生率，減少肺癌小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)，增加新生血管形成標(biāo)志物CD31表達(dá)但降低血清中血管紊亂標(biāo)志物5-HIAA水平；新生血管形成抑制劑Vadimezan雖然降低新生血管形成標(biāo)志物CD31表達(dá)，卻增加血清中5-HIAA水平，提高肺癌發(fā)生率，增加肺癌小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)；另外，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤組織含水量升高時(shí)組織中5-HIAA和水通道蛋白1的表達(dá)增加，