線粒體DNA A-loop基因多態(tài)性與慢性腎臟病發(fā)病風險關系的研究.pdf

1、目的:慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是危害人們健康的一種重要疾病，其臨床表現(xiàn)在各個階段不盡相同。進入腎衰竭期以后，可表現(xiàn)為急性心力衰竭、高鉀血癥、胃腸道出血、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等，甚至出現(xiàn)生命危險。該病在世界范圍內發(fā)病率很高，最近的發(fā)病率研究調查顯示，在我國成年人中，慢性腎臟病的發(fā)生率很高，可達到10.8％。CKD的疾病發(fā)生及發(fā)展是一個多種因素造成的、多個發(fā)展階段的綜合過程，其易患因素主要有年齡、糖尿病

2、、肥胖、代謝異常、高蛋白飲食、高血脂、高尿酸血癥等，但上述因素已不能完全解釋慢性腎臟病的高發(fā)病率。研究顯示，遺傳因素在CKD的疾病發(fā)生及發(fā)展過程中起著至關重要的作用。人體細胞內的DNA易受氧化應激損傷，細胞核內的DNA因與組蛋白結合而不易受到氧化應激的損傷，即使受到損傷，核內存在的某些內切酶也能有效的修復受損的DNA。而位于細胞質內的線粒體DNA(mitochondrialDNA，MtDNA)由于其缺乏組蛋白的保護和有效的修復機制，因而

3、更容易發(fā)生損傷而導致突變。MtDNA的突變可發(fā)生在整個基因序列的各個位點處，但主要仍集中在包括D環(huán)(displacement loop，D-loop)在內的非編碼區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，MtDNA D-loop區(qū)域的基因多態(tài)性與衰老以及多種疾病的發(fā)生有關，如血液透析、冠狀動脈疾病和癌癥等，但其與CKD的關系鮮有報道。因此，本實驗擬對CKD患者和健康人MtDNA D-loop區(qū)的序列進行檢測，探討MtDNA D-loop區(qū)的基因多態(tài)性與慢性腎臟病

4、發(fā)病風險的關系。
　　方法:
　　1、實驗對象
　　選取98例慢性腎臟病5期患者為病例組，所有患者均于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院血液凈化中心行維持性血液透析治療，其中包括53名男性，45名女性。入選標準:①規(guī)律透析時間≥6個月;②透析頻次2-3次/周，每次透析4-4.5小時;③近1月內無創(chuàng)傷、急性感染及其他疾病活動;④近2周未使用抗氧化劑及降脂藥物的患者;⑤近3個月促紅素用法及用量不變;⑥自愿參加此實驗研究。排除標準:①肝功

5、能損傷較嚴重;②自身免疫性疾病存在活動;③嚴重的營養(yǎng)不良。選取于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康人159例為對照組，其中96名男性，女63名女性。入選標準:所有入組人群均無腎臟病的病史或癥狀，無嚴重的心臟和肝臟疾病，無慢性腎臟病家族史。本實驗已獲取河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均自愿參加本研究，并簽署知情同意書。
　　2、實驗方法
　　收集兩組人群的臨床資料，包括年齡、性別等。整夜禁食后采集兩組人群

6、的靜脈血液標本，提取血中白細胞DNA。采用聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)擴增MtDNA D-loop區(qū)基因片段，于1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳，確認目的片段成功擴增后送檢進行測序。確定D-loop序列使用Snapshot基因測序法，由于MtDNA D-loop區(qū)基因序列較長，固采用雙向重復測序的方法檢測同一樣本。使用DNAman軟件將線粒體文庫中的Revised Cambridge Refer

7、ence Sequence(rCRS)標準序列與所測D-loop序列進行比對，確定MtDNA D-loop內的多態(tài)性位點在病例組及對照組中出現(xiàn)的頻率，并進行統(tǒng)計學分析。
　　3、統(tǒng)計分析
　　采用SPSS17.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，MtDNA D-loop的多態(tài)性位點在兩組之間發(fā)生率的比較采用x2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、病例組及對照組一般資料分析:兩

8、組間年齡、性別分布差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.166和0.363），兩組匹配。
　　2、MtDNA D-loop的基因多態(tài)性:兩組人群在MtDNA的D-loop區(qū)共發(fā)現(xiàn)103個多態(tài)性位點。其中有27個多態(tài)性位點在健康對照組和（或）病例組中出現(xiàn)的頻率大于5％。
　　3、MtDNA D-loop的基因多態(tài)性與CKD發(fā)病風險的關系:與健康對照組相比，CKD患者73位點A突變?yōu)镚的頻率顯著升高(99％vs0％，P＜0.001)，

9、146位點T突變?yōu)镃的頻率顯著升高（16.3％vs0％，P＜0.001），150位點T突變?yōu)镃的頻率顯著升高（15.3％vs0％，P＜0.001），195位點T突變?yōu)镃的頻率顯著升高（7.1％vs0％，P=0.003），16266位點C突變?yōu)镃A的頻率顯著升高（6.1％vs0％，P=0.006），其余位點的突變率在兩組中無明顯差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　D-loop區(qū)73位點A突變?yōu)镚、146位點T突變?yōu)镃、15