線粒體D環(huán)區(qū)單核苷酸多態(tài)性與喉癌發(fā)生風險關(guān)系的研究.pdf

1、目的：喉癌（laryngeal carcinoma）是耳鼻咽喉-頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)的頭頸部腫瘤中大約占26％-30%[1]。近年來，隨著吸煙人群的增多和環(huán)境的逐漸惡化，喉癌的發(fā)病率日趨增加，對人類健康、生命的威脅日益增加。隨著現(xiàn)代醫(yī)學及實驗技術(shù)的發(fā)展，近幾年來已有學者提出線粒體DNA(mitochondria DNA,mtDNA)發(fā)生了變異是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有著不可或缺的緊密關(guān)系。線

2、粒體DNA是高等動物中核外遺傳物質(zhì)的唯一存在場所，人類mtDNA是由16569個堿基組成的雙鏈閉合分子結(jié)構(gòu)，包含13種多肽編碼基因、2種核糖體RNA基因和22種轉(zhuǎn)運RNA基因，在線粒體蛋白質(zhì)的合成過程中發(fā)揮重要作用。D-loop區(qū)是人類線粒體DNA的一段非編碼區(qū)域，位于mtDNA16024bp-576bp，在整個mtDNA序列中僅占6%，但其發(fā)生突變的幾率以及多態(tài)性卻較其他區(qū)域明顯增高，該區(qū)包含復制起始點、轉(zhuǎn)錄啟動子等在mtDNA復制與

3、轉(zhuǎn)錄過程中的起主導作用的重要結(jié)構(gòu)，因此控制著mtDNA的復制與轉(zhuǎn)錄。本研究采用PCR和DNA測序的方法，對71例喉癌患者D-loop區(qū)的基因序列進行檢測，分析探索D-loop區(qū)單核苷酸多態(tài)性與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為喉癌的早期診斷、治療與預后判斷提供新途徑。
　　方法：
　　1.研究對象及標本采集：選取2013年6月至2016年11月于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科住院并行手術(shù)治療的71例喉癌患者作為本研究的對象，年齡

4、在39-73歲，均為男性。在獲取患者及家屬知情同意后，采集患者外周靜脈血3ml，將其放置在-4度冰箱內(nèi)冷藏保存，總計71例。此外，選取2012年至2013年間159例在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院體檢的正常人作為對照組，將體檢資料做詳細記錄，并在取得本人的知情同意后采集外周靜脈血標本3ml。所有標本的采集均由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理辦公室的委員會審核、同意并批準。
　　2.實驗及分析方法：使用DNA純化試劑盒對喉癌患者外周靜脈血以及

5、>　　正常對照組外周靜脈血標本進行線粒體DNA提取，需進行定量鑒定，經(jīng)鑒定達標后對標本組織進一步做聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）,使設計的mtDNA D-loop區(qū)的目的片段得以擴增，并對擴增產(chǎn)物進行DNA測序，同一標本采用雙向重復測序。將結(jié)果與目前公認的劍橋標準序列作對比、分析（BLAST），總結(jié)mtDNA D-loop區(qū)突變與喉癌的關(guān)系。
　　3.統(tǒng)計分析：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS21.

6、0統(tǒng)計軟件對計數(shù)資料應用2檢驗計算P值，相對危險度(OR值)及95%可信區(qū)間（CI），P＜0.05則差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.將喉癌組與對照組的臨床資料作比對發(fā)現(xiàn)：二者的性別與吸煙史有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。二者＜40歲與≥40歲的分布頻數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。
　　2.參照被公認為標準的RA Cambridge序列，在71例喉癌組與159例對照組中的982bp的測序結(jié)果中共發(fā)現(xiàn)146個多態(tài)性

7、改變，多態(tài)率為14.9%，其中有2個位點為新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點。喉癌組與對照組共發(fā)現(xiàn)25個高頻多態(tài)性位點。
　　3.用檢驗對喉癌組與正常對照組mtDNA D-Loop區(qū)的單核苷酸多態(tài)性的分布頻率作比對，發(fā)現(xiàn)73G/A、309C/C insert、315 C/C insert、524C/del、556A/del、16288C/T、16291T/C、16311C/T、16319A/G這9個多態(tài)性變異位點與喉癌的發(fā)病相關(guān)。
　　在7

8、3位點，喉癌組有71例（100.0%）患者出現(xiàn)A堿基被G堿基替換，正常對照組出現(xiàn)了89例（56%），73G基因型在喉癌組的分布頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　在309位點，喉癌組有24例（33.8%）患者出現(xiàn)1個C堿基插入，而在正常對照組出現(xiàn)了116例（73.0%），309C insert基因型在喉癌組的分布頻率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　在315位點，有30例（42.

9、3%）喉癌患者出現(xiàn)C堿基插入，正常對照組中有149例（93.7%）出現(xiàn)C堿基插入現(xiàn)象，315C insert基因型在喉癌組的分布頻率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　在524位點，喉癌組出現(xiàn)C堿基缺失的有20例（28.2%），對照組有1例（0.6%），524C del基因型在喉癌組分布頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　在556位點，喉癌組有6例（8.5%）存在A堿基缺失，對照組

10、無A堿基缺失，556A del基因型在喉癌組的分布頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　在16288位點，喉癌組有4例（5.6%）存在T堿基被C堿基替換，對照組無改變，16288C基因型在喉癌組的分布頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.013）。
　　在16291位點，喉癌組有8例（11.3%）出現(xiàn)C堿基被T堿基替換，對照組出現(xiàn)2例（1.3%），16291T基因型在喉癌組的分布頻率明顯高于對照

11、組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.020）。
　　在16311位點，喉癌組有14例（19.7%）出現(xiàn)T堿基被C堿基替換，對照組有15例（9.4%），16311 C基因型在喉癌組的分布頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.030）。
　　在16319A位點，喉癌組有4例（5.6%）出現(xiàn)G堿基被A堿基替換，對照組有25例（15.7%），16319A基因型在喉癌組的分布頻率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.033）。

12、>　　4.把與喉癌相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms， SNPs）分別同患者的臨床特征作比較，結(jié)果示16291T基因型在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（37.5%）中的分布頻率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（3.6%）高，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。其他與喉癌發(fā)病相關(guān)的SNPs和患者腫瘤直徑大小、分化程度、臨床分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及UICC TNM分期等臨床特征無關(guān)，差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　

13、　結(jié)論：
　　1.喉癌多發(fā)生于常年吸煙的男性。
　　2.喉癌患者的D-Loop區(qū)具有高度多態(tài)性，高頻多態(tài)性位點在HV1、HV2、HV3這三個高變區(qū)均有分布，多態(tài)性的主要形式單堿基的置換，部分表現(xiàn)為插入與缺失。
　　3.在所有喉癌樣本中均發(fā)現(xiàn)了73G/A這一改變，穩(wěn)定性有待于進一步研究。
　　4.mtDNA D-Loop區(qū)的SNPs與喉癌發(fā)病風險有相關(guān)性，73G、524del、556del、16288C、16291