MicroRNA結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性肝癌發(fā)生及其預(yù)后的關(guān)系.pdf

1、目的:MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)小型非編碼RNA,由大約22個(gè)核苷酸組成,其由染色體DNA編碼,在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的功能。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),miRNA具有調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生等生物學(xué)功能,miRNA主要通過(guò)與靶mRNA的3'UTR(3'非翻譯區(qū))完全或不完全的堿基互補(bǔ)結(jié)合,以實(shí)現(xiàn)其負(fù)性調(diào)節(jié)靶mRNA的功能,進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。MiRNA在基因上的結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與人類(lèi)腫瘤發(fā)生

2、關(guān)系密切,但關(guān)于miRNA結(jié)合位點(diǎn)SNP與原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究甚少。本研究擬通過(guò)對(duì)與腫瘤密切相關(guān)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)SNP進(jìn)行測(cè)序分析,并隨訪相應(yīng)原發(fā)性肝癌患者,進(jìn)行生存分析,結(jié)合病例一對(duì)照研究,鑒定出與肝癌發(fā)生及預(yù)后相關(guān)的特異SNP位點(diǎn),對(duì)分析探討個(gè)體和腫瘤易感因素的關(guān)系,篩查易患肝癌的高危人群,以及進(jìn)行預(yù)后的評(píng)價(jià),建立有效的預(yù)警機(jī)制均具有重要意義。
　　 方法:
　　 1.研究對(duì)象:肝癌組患者為2007年9月～200

3、8年3月間,在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科住院的手術(shù)患者,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)等檢查,臨床診斷為原發(fā)性肝癌,行原發(fā)性肝癌根治手術(shù),所有患者皆經(jīng)術(shù)后病理明確診斷為肝細(xì)胞癌,肝癌組60例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的標(biāo)本,均取自手術(shù)切除的腫瘤組織；對(duì)照組60例抗凝靜脈血標(biāo)本,均來(lái)自2008年10月～2009年4月間,在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院采集的正常人靜脈血樣。
　　 2.基因組DNA提取:用DNA純化試劑盒提取組織及血標(biāo)本的基因組DNA,提取后置于

4、4℃恒溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　 3. PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增miRNA結(jié)合位點(diǎn)目的片段:在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與12個(gè)miRNA結(jié)合的SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的目的基因,設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,用PCR預(yù)混試劑盒(無(wú)色體系)進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)后,送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。
　　 4.隨訪:通過(guò)電話(huà)隨訪原發(fā)性肝癌患者術(shù)后的生存情況。
　　 5.統(tǒng)計(jì)分析:

5、采用t檢驗(yàn)比較計(jì)量資料,用X2檢驗(yàn)分析肝癌組與對(duì)照組的SNP分布頻率,采用Kaplan-Meier方法估計(jì)組間生存率和繪制累計(jì)生存函數(shù)曲線(xiàn),用Log-Rank方法對(duì)各組生存曲線(xiàn)分布的異同進(jìn)行檢驗(yàn),比較生存率有無(wú)差別。
　　 所有數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:對(duì)與miRNA在基因上結(jié)合的12個(gè)SNP位點(diǎn)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序,發(fā)現(xiàn)rs12583、rs1128665、rs

6、17703261、rs14109、rs17107469、rs10463六個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),低頻率等位基因出現(xiàn)率極小,測(cè)序結(jié)果顯示其基因型單一,不適宜進(jìn)行相關(guān)分析,因此篩選出rs1044129a、rs4901706、rs16917496、rs1053667、rs11337、rs3660六個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行隨后的研究。
　　 1.對(duì)與miRNA在基因上結(jié)合的6個(gè)位點(diǎn)的SNP分布頻率分析顯示,在肝癌組和對(duì)照組之間,rs16917496、rs

7、1053667、rs11337、rs3660多態(tài)性位點(diǎn)各組間比較,發(fā)現(xiàn)此四個(gè)位點(diǎn)SNP分布頻率無(wú)明顯差異。而對(duì)于RYR3基因的多態(tài)位點(diǎn)rs1044129a,A/A、A/G基因型頻率存在差異(X2=5.562,P=0.018),A/A、A/G+G/G基因型頻率存在差異(X2=4.261,P=0.039)；對(duì)于C14orf101基因的多態(tài)位點(diǎn)rs4901706,G/G、A/G基因型頻率存在差異(X2=5.022,P=0.025),G/G、A

8、/G+A/A基因型頻率存在差異(X2=5.647,P=0.017),G、A等位基因型頻率存在差異(X2=4.843,P=0.028)。以上結(jié)果說(shuō)明,RYR3基因的rs1044129a位點(diǎn)和C140rf101基因的rs4901706位點(diǎn)的SNP分布頻率存在差異,其與原發(fā)性肝癌發(fā)生相關(guān)。
　　 2.對(duì)與miRNA在基因上結(jié)合的6個(gè)SNP位點(diǎn),各基因型原發(fā)性肝癌患者的生存率進(jìn)行分析,rs1044129a、rs4901706、rs169

9、17496、rs11337、rs3660五個(gè)多態(tài)位點(diǎn),各基因型患者組間生存率無(wú)明顯差別。而對(duì)于KIAA0423基因的多態(tài)位點(diǎn)rs1053667,T/T(38)、C/T(15)、C/C(3)基因型患者的2年生存率分別為44.74％、40.00％、0.00％,其中T/T、C/C基因型患者兩組間生存率有差別(P=0.0054)。結(jié)合生存函數(shù)曲線(xiàn)分析,和其他基因型比較,C/C基因型患者生存期最短,C/C基因型與患者生存率呈負(fù)相關(guān),C等位基因可能

10、為控制遺傳、影響原發(fā)性肝癌患者生存率的隱性基因。以上結(jié)果說(shuō)明,KIAA0423基因的rs1053667位點(diǎn)SNP與原發(fā)性肝癌預(yù)后相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在肝癌組與對(duì)照組之間,RYR3基因的多態(tài)位點(diǎn)rs1044129a的SNP和C140rf101基因的多態(tài)位點(diǎn)rs4901706的SNP分布頻率存在差異,此兩個(gè)位點(diǎn)可能是與原發(fā)性肝癌發(fā)生相關(guān)的SNP位點(diǎn)。
　　 2.對(duì)于KIAA0423基因的多態(tài)位點(diǎn)rs105