江豚Neophocaena phocaenoides單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)SNPs篩選的方法學(xué)研究.pdf

1、本論文共包括四個(gè)部分： 1)綜述了單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)標(biāo)記及其在生態(tài)、進(jìn)化和種群生物學(xué)中的應(yīng)用。 2)構(gòu)建江豚(Neophocaena phocaenoides)的基因組霰彈槍法文庫(kù)(whole-genome shotgun library)，通過克隆測(cè)序獲得了83個(gè)序列。根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)了68對(duì)引物，其中63對(duì)能進(jìn)行成功的PCR擴(kuò)增。通過63對(duì)引物在

2、24個(gè)江豚個(gè)體中擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜(denaturing high performanceliquid chromatography，DHPLC)分析，發(fā)現(xiàn)其中20對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)多態(tài)，并通過測(cè)序驗(yàn)證確定其中18個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物中含有SNPs。通過進(jìn)一步的篩選，共確定29個(gè)SNPs，其中顛換7個(gè)，轉(zhuǎn)換21個(gè)，插入/缺失1個(gè)。盡管DHPLC分析時(shí)的假陽性率為lO％左右，但構(gòu)建基因組文庫(kù)結(jié)合DHPLC的方法仍可以用于非模式生物SNPs

3、的大規(guī)模篩選。 3)選擇2個(gè)已知的江豚SNPs，將擴(kuò)增產(chǎn)物按基因頻率制備成0-50％的11個(gè)DNA池(DNA pooling)，分別用于直接測(cè)序和DHPLC分析，以探討兩種方法檢測(cè)SNPs時(shí)的效率及制備DNA池時(shí)對(duì)基因頻率的要求。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)任换虻念l率不少于12.5％時(shí)可在DHPLC分析時(shí)能予以明確地分辨，但當(dāng)用DNA池進(jìn)行直接測(cè)序時(shí)則頻率需要達(dá)到20％。這提示，為保證DHPLC分析的準(zhǔn)確性，制備DNA池時(shí)等摩爾DNA混合的

4、樣品數(shù)應(yīng)盡量不超過4個(gè)。DNA池結(jié)合DHPLC技術(shù)的高效性與準(zhǔn)確性可在大規(guī)模的SNPs位點(diǎn)篩選中發(fā)揮作用。 4)通過比較錨定序列示蹤(comparative anchor tagged sequences，CATS)法，選擇人、小鼠及其它哺乳動(dòng)物中已知的5對(duì)CATS引物，通過PCR反應(yīng)從江豚基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段，結(jié)合DHPLC和DNA直接測(cè)序等技術(shù)，進(jìn)行江豚單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的篩選。通過不同個(gè)體同源序列的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)