WNK3對(duì)鈉氯協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)子的調(diào)節(jié)及在胚腎細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分WNK3和NCC質(zhì)粒的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建帶有HA、GFP、Myc各種標(biāo)記的WNK3和NCC質(zhì)粒。
　　方法:應(yīng)用試劑盒提取人全血DNA，采用50ul反應(yīng)體系，應(yīng)用設(shè)計(jì)好的WNK3引物，提取以人DNA為模板WNK3片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳并回收純化。選擇EcoRI和Xho I酶切位點(diǎn)，打開空白質(zhì)粒環(huán)，作為WNK3接入點(diǎn)，將WNK3激酶和pCMV-HA Vect

2、or（帶HA標(biāo)記的空載體）各50ul體系，在PCR儀中設(shè)定37℃，運(yùn)行四小時(shí)同時(shí)進(jìn)行酶切，使兩者可以形成互補(bǔ)片段。采用含T4 DNA ligase的20 ul體系在PCR儀器設(shè)置16℃過夜，連接WNK3片段和pCMV-HA Vector，制備感受態(tài)大腸桿菌，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌，加入SOC培養(yǎng)液，37℃225～250 rpm振蕩培養(yǎng)至混濁，接種到培養(yǎng)皿上，挑選單克隆菌落，重新在大腸桿菌中擴(kuò)增，使用QIAGEN Plasmid min

3、i Kit提取質(zhì)粒，將獲得的重組質(zhì)粒分成兩份，一份進(jìn)行EcoRI和Xho I酶鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，并回收純化。收集片段送Agencourt Bioscience Corporation測序，測序結(jié)果與GenBank中人WNK3基因序列進(jìn)行比對(duì)。測序正確的序號(hào)對(duì)應(yīng)單克隆質(zhì)粒即我們的目標(biāo)質(zhì)粒pCMV-HA-WNK3質(zhì)粒，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。類似方法合成pCMV-Myc-WNK3、PCMV-HA-NCC、pEGFP-N

4、1-NCC等系列質(zhì)粒。并將其轉(zhuǎn)染胚腎細(xì)胞HEK293和腎小管Cos-7細(xì)胞，觀察其熒光及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1）基因測序均正確;2）轉(zhuǎn)染細(xì)胞后免疫熒光觀察及后續(xù)實(shí)驗(yàn)提示質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)良好。
　　結(jié)論:我們利用基因工程成功構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)所需的質(zhì)粒，酶切鑒定及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)均符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　第二部分WNK3和NCC在Cos-7細(xì)胞上的分布及相互作用
　　目的:觀察WNK3、NCC在Cos-7細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上的分布，W

5、NK3對(duì)NCC蛋白表達(dá)的劑量效應(yīng)，兩者有無直接相互作用。
　　方法:Cos-7細(xì)胞分2組，分別轉(zhuǎn)染pEGFP-NCC+ pCMV-HA-Vector（作為對(duì)照）和pEGFP-NCC+ pCMV-HA-WNK3，培養(yǎng)36小時(shí)后加抗HA熒光二抗，在免疫熒光顯微鏡下檢測兩種蛋白分布。轉(zhuǎn)染前一天細(xì)胞分離傳代，在2個(gè)10 cm培養(yǎng)皿接種Cos-7細(xì)胞，放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱內(nèi)，24小時(shí)內(nèi)觀察細(xì)胞生長密度在30-40％時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。

6、Cos-7細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP-NCC或同時(shí)轉(zhuǎn)染HA-WNK3，使用anti-HA及壁珠收集WNK3蛋白，血清作為對(duì)照。洗脫后跑蛋白印跡檢測NCC，觀察WNK3對(duì)NCC蛋白有無直接調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:1）免疫共聚焦顯微鏡可以觀察到WNK3主要分布在Cos-7的細(xì)胞漿，而NCC分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3后，NCC在胞漿和包膜的表達(dá)量顯著增強(qiáng)。2）WNK3、NCC轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞，免疫印跡結(jié)果顯示:隨著WNK3劑量的

7、增加，NCC的表達(dá)水平顯著提高。3）Cos-7細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染GFP-NCC或同時(shí)轉(zhuǎn)染HA-WNK3，抗HA抗體可以使HA-WNK3免疫沉淀NCC，但未轉(zhuǎn)染HA-WNK3或血清作為一抗卻沒法使免疫沉淀NCC，提示W(wǎng)NK3和NCC可以直接相互作用。
　　結(jié)論:WNK3主要分布在Cos-7的細(xì)胞漿，而NCC分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。WNK3高表達(dá)可增強(qiáng)Cos-7細(xì)胞NCC表達(dá)量。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)提示兩者有直接相互作用的可能性。
　　第三部分

8、WNK3對(duì)NCC蛋白合成和降解過程的影響
　　目的:WNK3激酶是否通過影響NCC蛋白合成或降解途徑而增加NCC表達(dá)量。
　　方法:Cos-7細(xì)胞分2組，細(xì)胞貼壁生長豐度達(dá)到30-40％時(shí)分別轉(zhuǎn)染NCC和NCC+WNK3，培養(yǎng)48小時(shí)后兩組細(xì)胞均換成含有100ug/mlCHX(Cycloheximide from microbial)的培養(yǎng)液。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)0、1、2、4、6、8小時(shí)收集并裂解細(xì)胞，配制樣品蛋白。

9、進(jìn)行相關(guān)蛋白測定。2）Cos-7細(xì)胞分4組，向每組中轉(zhuǎn)染恒定劑量的NCC(0.5μg/組)，向第2、4中轉(zhuǎn)染相同劑量的WNK3(1μg/組)。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，第3、4加入質(zhì)子泵抑制劑BafA1(Baflomycine A1)阻斷溶酶體降解通路，1、2組中加入等量的DMSO。BafA1的使用終濃度均為0.5μnol/L。12小時(shí)后裂解細(xì)胞，配制樣品蛋白檢測NCC表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:1）單獨(dú)轉(zhuǎn)染NCC的Cos-7細(xì)胞，NCC蛋白

10、表達(dá)在CHX作用2小時(shí)后顯著降低，而WNK3+NCC組在CHX作用6小時(shí)后NCC才開始顯著減少。2）在第1，2組中，相對(duì)單獨(dú)轉(zhuǎn)染NCC組（第1組），WNK3激酶顯著增加了NCC蛋白表達(dá)（第2組），增加幅度達(dá)2倍(p＜0.05，n=4)。含有0.5μM BafA1培養(yǎng)液預(yù)處理Cos-7細(xì)胞后，單獨(dú)轉(zhuǎn)染NCC組（第3組）相對(duì)未經(jīng)Baf A1預(yù)處理的NCC組（第1組），NCC蛋白表達(dá)增加了50％(p＜0.05，n=4)。但Baf A1預(yù)處理的

11、WNK3+NCC組（第4組），較沒有Baf A1預(yù)處理的WNK3+NCC組（第2組）NCC上升不顯著，提示W(wǎng)NK3可能通過減少NCC溶酶體途徑降解，從而增加NCC表達(dá)量。
　　結(jié)論:WNK3激酶增加NCC蛋白表達(dá)可能通過減少NCC溶酶體降解途徑調(diào)控NCC，而與蛋白合成途徑無顯著相關(guān)。
　　第四部分ERK通路在WNK3調(diào)節(jié)NCC機(jī)制中的作用
　　目的:WNK3增加NCC總蛋白表達(dá)水平是否通過MAPK ERK1/2細(xì)胞信號(hào)

12、通路。
　　方法:Cos-7細(xì)胞傳代接種在6cm培養(yǎng)皿，分3組，每組均轉(zhuǎn)染0.5μ g pCMV-HA-NCC，各組分別轉(zhuǎn)染0、1、3ug pCMV-Myc-WNK3，培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞并裂解。使用anti-HA和anti Myc抗體、t-ERK和pERK抗體檢測相關(guān)蛋白。用Microchemi化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色條帶，測量目的及內(nèi)參的灰度值，取其比值作為結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:1）隨著WNK3劑量的增大，p-ERK1

13、/2的表達(dá)水平也隨之下降，表明WNK3以劑量依賴的方式抑制p-ERK1/2的表達(dá)。t-ERK1/2為p-ERK1/2的蛋白上樣內(nèi)參，表明ERK1/2的總量沒有變化。2)過表達(dá)WNK3可以上顯著增加Cos-7細(xì)胞的NCC表達(dá)量。與未轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。沉默ERK1/2表達(dá)本身可以增加NCC表達(dá)。但沉默ERK1/2可抑制WNK3介導(dǎo)的NCC表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:WNK3抑制p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，且與WNK3呈劑量依賴

14、關(guān)系，以上正反兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)WNK3通過MAPK ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)NCC的表達(dá)水平。
　　第五部分WNK3激酶對(duì)白介素-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
　　目的:觀察WNK3高表達(dá)對(duì)白介素-1β誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡有無保護(hù)作用。
　　方法:轉(zhuǎn)染前一天在6cm培養(yǎng)皿內(nèi)傳代HEK293細(xì)胞（共3組，每組3盤），細(xì)胞生長密度在40％時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，第一組和第二組轉(zhuǎn)染1μg PCMV-HA-Vector

15、，第三組轉(zhuǎn)染加入3μg WNK3，轉(zhuǎn)染4h后換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20h，細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/每孔的密度接種于96孔板，第二、三組培養(yǎng)液中加入10ng/ml IL-1β（第二組為陽性對(duì)照）;第一組培養(yǎng)液加入等量生理鹽水作為陰性對(duì)照。于37℃孵箱中孵育0h、12h、24h和36h時(shí)，使用CCK-8檢測細(xì)胞活性。
　　結(jié)論:1）IL-1β誘導(dǎo)HEK細(xì)胞活性下降，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK3可以有效部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞活性。2）WNK3通過Beclin抑