釀酒酵母Rad52基因轉(zhuǎn)化擬南芥及轉(zhuǎn)化體篩選技術(shù)研究.pdf

1、基因打靶是反向遺傳學(xué)基因功能研究的重要工具，但在植物轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因絕大多數(shù)隨機(jī)插入基因組中，通過同源重組定向插入的概率極低。近年來雖采用了多種方法提高基因打靶的效率，目前仍沒有達(dá)到實(shí)用水平。釀酒酵母轉(zhuǎn)基因主要通過同源重組的方式整合到基因組中，因而具有很高的打靶效率。把酵母等生物的同源重組機(jī)制引入植物可能是提高植物基因打靶效率的有效的途徑。Rad52蛋白是酵母與同源重組有關(guān)的關(guān)鍵酶，而絕大多數(shù)植物缺乏Rad52蛋白。本研究的主要目

2、的就是從酵母中克隆出Rad52基因，并把它導(dǎo)入到模式植物擬南芥中，以便進(jìn)一步研充Rad52基因?qū)χ参锿粗亟M及基因打靶效率的影響。 目前植物基因打靶的效率非常低，研究基因打靶需要建立非常有效的植物轉(zhuǎn)基因體系。擬南芥轉(zhuǎn)基因可以采用活體(原位)轉(zhuǎn)化法，在轉(zhuǎn)化階段可以完全不依賴組織培養(yǎng)技術(shù)，轉(zhuǎn)化步驟簡(jiǎn)單、高效。但轉(zhuǎn)基因種子的篩選基本上還依賴于無菌培養(yǎng)，工作量比較大，而且容易污染，造成實(shí)驗(yàn)材料的損失。本研究在前人技術(shù)的基礎(chǔ)上，著重對(duì)種

3、子篩選技術(shù)做了改進(jìn)，提出了三種不依賴于無菌培養(yǎng)的簡(jiǎn)單、可靠和高效的轉(zhuǎn)基因種子篩選方法。 本研究的主要結(jié)果如下： 1.從酵母基因組中克隆出同源重組關(guān)鍵基因Rad52，構(gòu)建出農(nóng)桿菌雙元載體，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法導(dǎo)入擬南芥野生生態(tài)型Columbia。獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR鑒定證實(shí)，Rad52基因已整合到基因組中。 2.提出了三種不依賴無菌培養(yǎng)的擬南芥轉(zhuǎn)基因種子篩選方法。其一是濾紙發(fā)芽篩選法，轉(zhuǎn)基因種子在含有篩

4、選劑的1/4MS大量元素液體的濾紙上進(jìn)行發(fā)芽篩選。其二是水瓊脂發(fā)芽篩選法，用含篩選劑的1/4MS大量元素加0.8％的瓊脂固化，由于水瓊脂不含蔗糖和其他有機(jī)物質(zhì)，加上抗菌素的作用，細(xì)菌不會(huì)在短期內(nèi)繁殖，真菌的繁殖也很有限，從而實(shí)現(xiàn)非無菌操作篩選。其三是篩選劑浸種篩選法，讓轉(zhuǎn)基因種子在低溫處理和萌發(fā)階段在含篩選劑的1/4MS大量元素的液體中進(jìn)行，剛萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)土中。三種方法與已有的方法相比都有簡(jiǎn)單、可靠、高效的特點(diǎn)，解決了擬南芥轉(zhuǎn)化