PKCγ-P2X3介導(dǎo)PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性改變-痛覺敏化-去敏化的作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)是指?jìng)€(gè)體經(jīng)歷異乎尋常突發(fā)威脅性或?yàn)?zāi)難性創(chuàng)傷應(yīng)激事件，導(dǎo)致延遲出現(xiàn)及慢性持續(xù)存在的生理、心理障礙。PTSD主要表現(xiàn)為病理性重現(xiàn)，即持續(xù)重復(fù)體驗(yàn)創(chuàng)傷事件的經(jīng)歷、高度的警覺性、反應(yīng)麻木與情感淡漠及逃避回憶等特征性癥候群。
　　PTSD伴發(fā)病、共病多且難治。PTSD與疼痛發(fā)生及痛覺敏化/去敏化的形成有密切的關(guān)系。PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟痛覺敏化/去敏感化關(guān)聯(lián)疾病，如PTSD后腸易激綜合征(IBS

2、)、膀胱疼痛綜合征的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。PTSD樣應(yīng)激可能是IBS內(nèi)臟痛敏觸發(fā)、加重的重要因素。既往有關(guān)PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下痛覺敏化/去敏感的研究主要聚焦于大腦的下丘腦、海馬、杏仁核、內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)和前扣帶等，但目前以單純的下丘腦-垂體-腎上腺軸應(yīng)激理論為靶點(diǎn)開發(fā)的藥物療效欠佳。為此，尋找新的有效的治療靶點(diǎn)有十分重要的價(jià)值。新近有研究提示脊髓及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)在應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)臟痛覺敏化/去敏化的形成和維持中亦發(fā)揮了重要作用，且應(yīng)激狀態(tài)下

3、脊髓中樞水平敏化和外周DRG水平敏化的研究逐漸成該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。迄今為止，尚不清楚PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟敏感改變-痛覺敏化/去敏感的確切分子機(jī)制及防治措施。
　　嘌呤核苷酸P2受體亞型3(P2X3)高度選擇性地表達(dá)于中、小直徑DRG神經(jīng)元中，蛋白激酶Cγ亞型(PKCγ)主要分布于脊髓背的Ⅱ?qū)觾?nèi)側(cè)部及Ⅲ層的交界處。諸多研究證實(shí)，PKCγ/P2X3在DRG和脊髓水平介導(dǎo)了疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)及其痛覺敏化的過程。PKCγ在靜息時(shí)無活性，當(dāng)

4、受到外界刺激后神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度增加，PKC發(fā)生轉(zhuǎn)位而被激活;而PKCγ的激活引起通道電容的改變、多種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、疼痛相關(guān)受體激活的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。既往采用神經(jīng)病理性痛、炎癥性、癌性痛等研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角PKCγ的表達(dá)明顯升高，鞘內(nèi)給予PKC特異性阻斷劑GF109203X可逆轉(zhuǎn)痛覺敏化現(xiàn)象，而在PKCγ基因敲除小鼠未觀察到痛覺敏化的發(fā)生。既往亦發(fā)現(xiàn)P2X3參與了多種痛覺敏化/去敏化的發(fā)生，如在神經(jīng)痛、炎性痛、骨癌痛大鼠模型DR

5、G神經(jīng)元P2X3表達(dá)明顯增加，其介導(dǎo)的ATP激活的門控通道電流顯著增強(qiáng);應(yīng)用P2X3受體激動(dòng)劑α，β-me ATP可誘導(dǎo)痛覺敏化，而P2X3受體特異性阻斷劑TNP-ATP可逆轉(zhuǎn)痛覺敏化，基因敲除鼠的P2X3受體其痛覺反應(yīng)性降低。另有研究證實(shí)，PKCγ/P2X3之間存在相互作用，共同調(diào)控痛覺敏化/去敏化的形成。P2X3受體的結(jié)構(gòu)上N末端與PKC結(jié)合后，可導(dǎo)致PKC磷酸化;改變P2X3受體上的PKC結(jié)合位點(diǎn)或采用PKC抑制劑阻斷其作用后，可

6、減少α，β-me ATP誘發(fā)的P2X3受體內(nèi)向電流;PKC的活化可使DRG上α，β-me ATP誘發(fā)的P2X3受體電流增加。根據(jù)上述理論基礎(chǔ)，我們推測(cè):PKCγ/P2X3介導(dǎo)PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性改變—痛覺敏化/去敏化的作用及機(jī)制。旨在為PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下痛覺敏化/去敏化的臨床防治提供新的思路。
　　方法：
　　1.選用健康成年SD雌性大鼠，采用連續(xù)單一應(yīng)激(SPS)聯(lián)合足底電擊建立PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性改

7、變的動(dòng)物模型;
　　2.采用結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)-VMR和AWR評(píng)估正常對(duì)照組、PTSD術(shù)后1、6、7、9、14、21、28、29天時(shí)內(nèi)臟敏感性改變/痛行為學(xué)變化;
　　3.采用免疫熒光漂染技術(shù)聯(lián)合激光共聚焦顯微技術(shù)、Western blot技術(shù)研究DRG中P2X3及脊髓背角PKCγ表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化;
　　4.采用鞘內(nèi)注射PKCγ阻斷劑GF109203X和P2X3受體阻斷劑TNP-ATP方法，觀察GF109203X和

8、TNP-ATP分別對(duì)PTSD大鼠內(nèi)臟敏感性/痛行為學(xué)的影響;
　　5.采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下DRG神經(jīng)元上P2X3受體電生理特性的改變，及TNP-ATP的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　第一部分 PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下VMR和AWR的動(dòng)態(tài)變化
　　采用CRD-VMR和AWR評(píng)估正常對(duì)照組、PTSD術(shù)后1、6、7、9、14、21、28、29天時(shí)內(nèi)臟敏感性改變。在40、60mmHg壓力下行CRD時(shí)PT

9、SD術(shù)后1天組其曲線下面積(AUCVMR)值和AWR值明顯低于正常對(duì)照組，PTSD術(shù)后6天組AUCVMR值和AWR值逐漸恢復(fù)至正常水平。然而在PTSD術(shù)后7天組，在40、60mmHg壓力下時(shí)AUCVMR值和AWR值明顯升高，并且持續(xù)到PTSD術(shù)后28天，在PTSD術(shù)后9天時(shí)AUCVMR值和AWR值達(dá)到高峰。在PTSD術(shù)后29天組其AUCVMR值和AWR值恢復(fù)至正常。
　　第二部分 PKCγ在脊髓中樞水平介導(dǎo)PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟

10、敏感性改變—痛覺敏化/去敏化的作用機(jī)制
　　1.PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下脊髓背角PKCγ表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
　　采用免疫熒光漂染/激光共聚焦顯微技術(shù)/Western blot技術(shù)研究發(fā)現(xiàn):PKCγ陽性產(chǎn)物主要分布于脊髓背角Ⅱ、Ⅲ層。PTSD術(shù)后1天組的大鼠PKCγ蛋白的平均熒光強(qiáng)度值(AOD)和Western blot的相對(duì)光密度值(ROD)低于正常對(duì)照組，PTSD術(shù)后6天時(shí)表達(dá)水平與正常對(duì)照組無差異。在PTSD術(shù)后7天開始明顯升高

11、，第9天時(shí)到高峰，且一直持續(xù)至28天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其后在PTSD術(shù)后29天PKCγ表達(dá)開始降低。
　　2.在PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下鞘內(nèi)注射不同濃度梯度的PKCγ阻斷劑GF109203X對(duì)內(nèi)臟敏感性/痛行為學(xué)的影響
　　PKCγ的表達(dá)在PTSD術(shù)后9天時(shí)達(dá)到高峰，故選擇在PTSD術(shù)后9天行鞘內(nèi)注射PKCγ特異性阻斷劑GF109203X，觀察不同濃度梯度的GF109203X對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性/痛行為學(xué)的影響。結(jié)果顯示，在PTS

12、D術(shù)后9天時(shí)鞘內(nèi)注射低濃度的GF109203X（0.05-0.15 nmol/10μL）時(shí)，其AUCVMR和AWR的值與空白對(duì)照組沒有顯著差別。鞘內(nèi)注射0.30 nmol/10μL濃度的GF109203X在40 mmHg水平壓力下行CRD時(shí)其AUCVMR值和AWR的值降低，但在60mmHg水平壓力下其AUCVMR值和AWR的值與空白對(duì)照組沒有顯著差異。然而鞘內(nèi)注射0.50 nmol/10μL濃度的GF109203X在40、60mmHg水

13、平壓力下行CRD時(shí)其AUCVMR值和AWR的值均呈現(xiàn)顯著降低，在PTSD術(shù)后7、14、21、28天分別鞘內(nèi)注射0.50 nmol/10μL濃度的GF109203X可以觀察到其AUCVMR和AWR的值與空白對(duì)照組比較明顯降低，這表明GF109203X在0.50nmol/10μL的濃度時(shí)可完全抑制PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下的內(nèi)臟高敏感現(xiàn)象。
　　第三部分 P2X3在外周水平介導(dǎo)PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性改變—痛覺敏化/去敏化的作用機(jī)制<

14、br>　　1.PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下DRG上P2X3表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
　　P2X3高度選擇性地表達(dá)于與傷害性感受和痛覺有關(guān)的中、小直徑DRG神經(jīng)元中。我們對(duì)正常對(duì)照組，PTSD術(shù)后1、6、7、14、21天組大鼠的DRG行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn):PTSD術(shù)后1天組的大鼠P2X3的AOD值低于正常對(duì)照組，PTSD術(shù)后6天時(shí)表達(dá)水平與正常對(duì)照組無差異。在PTSD術(shù)后7、14和21天時(shí)與正常對(duì)照組比較均明顯升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中在PTSD術(shù)后第

15、7天時(shí)達(dá)到高峰。
　　2.PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下P2X3受體特異性阻斷劑TNP-ATP對(duì)內(nèi)臟敏感性/痛行為學(xué)的影響
　　因?yàn)榍懊鎸?shí)驗(yàn)提示P2X3的表達(dá)在PTSD術(shù)后7天時(shí)達(dá)到高峰，故選擇在PTSD術(shù)后7天行鞘內(nèi)注射TNP-ATP。在PTSD術(shù)后7天行CRD擴(kuò)張前10分鐘時(shí)，鞘內(nèi)注射TNP-ATP其AUCVMR值和AWR值在40 mmHg和60 mmHg可顯著降低，與PTSD術(shù)后7天對(duì)照組比較。
　　3.在PTSD樣應(yīng)激狀

16、態(tài)下大鼠DRG上P2X3受體電生理特性的變化，α，β-meATP誘發(fā)的P2X3內(nèi)向電流的改變及P2X3受體特異性阻斷劑TNP-ATP的抑制作用
　　α，β-me ATP作用于大鼠DRG神經(jīng)元后可引起Iα，β-meATP的內(nèi)向電流。與正常對(duì)照組比較，PTSD術(shù)后7天組，α，β-me ATP可使DRG神經(jīng)元P2X3受體介導(dǎo)的內(nèi)向電流幅度明顯增強(qiáng)，而選擇性P2X3受體拮抗劑TNP-ATP可完全抑制其誘發(fā)的內(nèi)向電流，經(jīng)5分鐘洗脫后TNP-

17、ATP的阻斷可完全恢復(fù)。
　　結(jié)論：
　　1.采用SPS聯(lián)合足底電擊的方法成功建立了PTSD內(nèi)臟敏感性改變-痛覺敏化/去敏化的動(dòng)物模型;PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性/痛行為學(xué)的發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化，PTSD樣應(yīng)激對(duì)VMR和AWR有明顯的影響;
　　2.PKCγ在脊髓中樞水平介導(dǎo)了PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)臟敏感性改變—痛覺敏化/去敏化的作用機(jī)制，PTSD樣應(yīng)激狀態(tài)下脊髓背角PKCγ表達(dá)發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化，鞘內(nèi)注射PKCγ阻斷劑GF