CBS上調(diào)P2X3受體表達參與腰椎間盤突出癥模型大鼠持續(xù)性痛覺高敏.pdf

1、目的:
　　1.探究P2X3受體在大鼠腰椎間盤突出誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛中的作用；
　　2.探討H2S信號分子在調(diào)節(jié)L5/L6背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體表達和功能中的作用特征。
　　方法:
　　1.采用200-220gSD雄性大鼠，取出自體尾椎的正常髓核組織，置于手術(shù)顯露后的腰5，6左側(cè)神經(jīng)根處，建立腰椎間盤突出癥動物模型（LDH）。分別在術(shù)前1天，術(shù)后3，7，14，21，28和35天運用VFF（Von Frey fi

2、laments）及雙足平衡實驗（Weight Bearing）的方法來評測SD大鼠的行為學(xué)疼痛閾值反應(yīng)。
　　2.運用逆行標(biāo)記的熒光素（Dil）來標(biāo)記支配后肢的L5/L6背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中、小神經(jīng)元，運用鈣成像方法研究腰椎間盤突出癥（LDH）大鼠L5/L6 DRG神經(jīng)元中ATP誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣信號反應(yīng)及神經(jīng)元的興奮性變化。
　　3.運用Western Blotting方法檢測LDH模型大鼠L5/L6 DRG神經(jīng)元中內(nèi)源性硫

3、化氫合酶CBS和CSE以及嘌呤受體P2XRs的蛋白表達情況。
　　4.運用免疫組織化學(xué)方法檢測LDH大鼠L5/L6 DRG神經(jīng)元中CBS和P2X3R蛋白共表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.自體尾椎髓核（NP）移植能夠顯著降低 LDH模型大鼠后肢的機械性疼痛閾值，并且這一現(xiàn)象是與L5/L6 DRG神經(jīng)元中硫化氫合酶CBS蛋白的表達上調(diào)相關(guān)聯(lián)的。
　　2.與假手術(shù)組（Sham）相比，LDH組增加了L5/L6背根神經(jīng)節(jié)（

4、DRG）中P2X3R的蛋白表達量，而P2X2R，P2X1R的蛋白表達量并沒有發(fā)生變化。
　　3.對LDH大鼠鞘內(nèi)注射硫化氫合酶CBS抑制劑AOAA后，發(fā)現(xiàn)AOAA能夠顯著的翻轉(zhuǎn)LDH大鼠的疼痛閾值，并呈現(xiàn)劑量和時間上的依賴性。而作為對照，AOAA并不能夠?qū)偈中g(shù)組SD大鼠的疼痛閾值產(chǎn)生作用。
　　4.對LDH大鼠鞘內(nèi)注射P2X3R的選擇性拮抗劑A-317491后，發(fā)現(xiàn)A-317491能夠顯著的翻轉(zhuǎn)LDH大鼠的疼痛閾值，并呈現(xiàn)

5、劑量和時間上的依賴性。
　　5.運用免疫組化的實驗方法檢測后發(fā)現(xiàn)硫化氫合酶CBS與P2X3R在L5/L6神經(jīng)元中能夠共表達。而且運用Western Blotting的方法進行檢測后發(fā)現(xiàn)，連續(xù)給予LDH大鼠AOAA能夠顯著翻轉(zhuǎn)NP引起的L5/L6神經(jīng)元中的P2X3R表達的上調(diào)。
　　6.全細胞膜片鉗記錄顯示，與Sham組相比，在LDH大鼠L5/L6 DRG上，NP能顯著增強ATP誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣信號。鞘內(nèi)連續(xù)給與硫化氫合酶CBS

6、抑制劑AOAA后可以抑制LDH大鼠中ATP誘導(dǎo)的鈣信號變化。
　　7.通過單次或連續(xù)給與LDH大鼠足趾注射硫化氫合酶CBS抑制劑AOAA后，發(fā)現(xiàn)AOAA不能夠翻轉(zhuǎn)LDH大鼠的疼痛閾值，而且運用Western Blotting的方法進行檢測后發(fā)現(xiàn)，連續(xù)足趾給藥后大鼠L5/L6神經(jīng)元中P2X3R表達未發(fā)生變化。
　　結(jié)論:
　　腰椎間盤突出癥模型（LDH）中髓核（NP）激活了內(nèi)源性硫化氫（H2S）合酶CBS表達的上調(diào)，通過