炎癥介導(dǎo)的外周神經(jīng)致敏在內(nèi)臟高敏感狀態(tài)發(fā)生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 功能性胃腸病患者常表現(xiàn)為內(nèi)臟對多種刺激的敏感性異常增高，而胃腸道并無臨床可檢測到的組織學(xué)異常。對這部分患者進(jìn)行直腸肛門測壓檢查常有初始感覺閾值及最大感覺閾值降低。另外，正常生理狀態(tài)下的某些刺激也可以引起這部分患者的胃腸道功能紊亂癥狀。近年來的研究提示，胃腸道的這種感覺過敏與感覺傳入通路異常有關(guān)，即一方面分布于腸壁內(nèi)感受多種刺激的受體敏感性異常增高，另一方面正常的內(nèi)臟傳入信號在脊髓、大腦水平被異常放大，產(chǎn)生過強(qiáng)的反應(yīng)。

2、 臨床上約l/3的功能性腸病患者可以追問到既往的腸道感染史。腸道炎癥引起的腹痛和腸動(dòng)力改變，至少部分是通過作用于腸神經(jīng)系統(tǒng)(包括內(nèi)在神經(jīng)系統(tǒng)和外來神經(jīng)系統(tǒng))引起的。這些改變有的可以痊愈，而有的則導(dǎo)致永久性的損傷，如炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)和腸道感染后腸易激綜合征(post infective irritable bowel syndrome，pI-IBS)。 炎癥

3、損傷胃腸神經(jīng)系統(tǒng)的效應(yīng)不僅可以發(fā)生在炎癥急性期，而且炎癥損傷后的神經(jīng)元再生以及神經(jīng)纖維重塑可以引起永久性的腸道感覺和運(yùn)動(dòng)功能改變，而組織學(xué)上可能并未發(fā)現(xiàn)異常，這也是功能性胃腸病重要的病理生理特征之一。因此研究炎癥對胃腸道感覺傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用，尤其是炎癥對腸神經(jīng)系統(tǒng)損傷的遠(yuǎn)期效應(yīng)，對于闡明功能性胃腸病患者對多種刺激如機(jī)械刺激、化學(xué)刺激及冷溫度刺激敏感性增高的機(jī)制具有重要的意義。研究目的 本研究通過建立實(shí)驗(yàn)性腸道炎癥模型，動(dòng)

4、態(tài)觀察了炎癥急性期以及炎癥反應(yīng)消退后不同時(shí)間，腸道感覺神經(jīng)傳導(dǎo)通路上多種感覺性受體(包括機(jī)械敏感性受體IGLEs、溫度敏感性受體TRFAl、傷害性刺激敏感性受體VRl)以及神經(jīng)遞質(zhì)(感覺性神經(jīng)遞質(zhì)CGRP)的活性及表達(dá)有無異常，以期闡明炎癥介導(dǎo)的外周神經(jīng)致敏在內(nèi)臟敏感性增高發(fā)病中的作用及其機(jī)制，為預(yù)防和治療功能性胃腸疾病、尤其是感染后腸易激綜合征(post-infective-irritable bowel syndrome，pI-IB

5、S)奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1．炎癥對胃腸道迷走神經(jīng)機(jī)械敏感性受體IGLEs的調(diào)節(jié)作用 用苯乙烯基染料FM1-43、FM2-10結(jié)合牽拉刺激顯示豚鼠消化道IGLEs的特意結(jié)構(gòu)，與Neurobiotin神經(jīng)順行標(biāo)記技術(shù)以及P2X2免疫組織化學(xué)法相結(jié)合，證明IGLEs是消化道迷走傳入神經(jīng)末梢的機(jī)械敏感性受體；給予不同的藥物促進(jìn)或阻斷IGLEs的激活，進(jìn)一步明確消化道機(jī)械敏感性受體的特性；建立三硝基苯磺酸(trini

6、trobenzene sulfonic acid，TNBS)實(shí)驗(yàn)性直腸炎動(dòng)物模型，用FM2-10結(jié)合牽拉刺激顯示炎癥直腸的IGLEs(rectum IGLEs，riGLEs)，在炎癥的急性期(給予TNBS后7天)及恢復(fù)期(給予TNBS后2l天及42天)，比較牽拉刺激激活的riGLEs的熒光強(qiáng)度有無差異，以期闡明炎癥對直腸機(jī)械敏感性的影響。 2．炎癥對腸肌間神經(jīng)叢及支配腸道的DRG神經(jīng)元CGRP和VRl表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

7、建立TNBS實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，在炎癥腸段的肌間神經(jīng)叢，用免疫組織化學(xué)方法顯示感覺性神經(jīng)遞質(zhì)CGRP和感受傷害性刺激的受體VRl陽性的突觸囊泡，比較炎癥急性期(給予TNBS后7天)與恢復(fù)期(給予TNBS后2 l天及42天)CGRP和VRl陽性突觸囊泡的熒光強(qiáng)度有無差異；另外，在支配炎癥腸段的DRG初級感覺神經(jīng)元中，用免疫組織化學(xué)方法顯示CGRP和VRl陽性的神元。比較炎癥急性期CGRP和VR1陽性神經(jīng)元的數(shù)量有無差異，以進(jìn)一步探討炎

8、癥對胃腸道感覺傳導(dǎo)通路的致敏作用。 3．炎癥對胃腸道及支配胃腸道的DRG感覺神經(jīng)元上TRPA1表達(dá)的調(diào)節(jié)作 在正常豚鼠胃腸道組織，用RT-PCR法、單細(xì)胞RT-PCR(single cell RT-PCR)及免疫組織化學(xué)法檢測溫度敏感性受體一一過性受體電位(transient receptor potential A1，TRPA1)在食道、胃底、直腸以及支配直腸的脊髓背根神經(jīng)節(jié)的表達(dá)；建立TNBS實(shí)驗(yàn)性直腸炎模型，用半定

9、量RT-PCR法比較炎癥急性期及恢復(fù)期炎癥直腸組織以及支配直腸的脊髓背根神經(jīng)節(jié)TRPA1的表達(dá)有無差異。 研究結(jié)果 1．消化道受牽拉刺激后FM1-43、FM2-10染色顯示的IGLEs的數(shù)目明顯多于未牽拉組(P<0.01)；Neurobiotin神經(jīng)順行標(biāo)記技術(shù)以及P2X<,2>免疫組織化學(xué)法顯示的IGLEs形態(tài)與牽拉刺激后FM1-43染色顯示的IGLEs形態(tài)完全一致。上皮鈉離子通道阻斷劑Benzamil可以明顯阻斷

10、IGLEs的激活。在炎癥急性期，TNBS牽拉組與未牽拉組的直腸riGLEs FM2-10的熒光強(qiáng)度均明顯高于對照組(P<0.01)；在炎癥恢復(fù)期，TNBS牽拉組直腸rIGLEs FM2-10的熒光強(qiáng)度仍高于對照牽拉組(P<0.05)，而TNBS未牽拉組與對照未牽拉組則無明顯差異(P>0.05)。 2．在炎癥急性期(給予TNBS后7天)，支配炎癥腸段的脊髓背根神經(jīng)節(jié)上CGRP和VR1陽性神經(jīng)元的比例明顯高于對照組(P<0.01)；

11、而在炎癥恢復(fù)期后，CGRP和VR1陽性神經(jīng)元的比例仍高于對照組(P<0.05)。炎癥急性期及恢復(fù)期(給予TNBS后21天)腸肌神經(jīng)叢上CGRP和VR1陽性突觸囊泡的熒光強(qiáng)度明顯高于對照組(P<0.01)；而恢復(fù)期后(給予TNBS后42天)，CGRP和VR1陽性突觸囊泡的熒光強(qiáng)度與對照組無明顯差異(P>0.05)。 3.TRPA1 mRNA在食道、胃底、直腸的粘膜及肌層，以及支配直腸的脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上均有表達(dá)，免疫組織化學(xué)

12、法顯示在支配直腸的脊髓背根神經(jīng)節(jié)上也存在著TRPAl的表達(dá)。炎癥急性期可以明顯增加直腸以及支配直腸的DRG神經(jīng)元上TRPAll mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)(p<0.01)，而且炎癥恢復(fù)期后(給予TNBS后21天、42天)TRPAl mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)仍明顯高于正常對照組(p<0.05)。 研究結(jié)論 1．IGLEs是消化道迷走傳入神經(jīng)末梢的機(jī)械敏感性受體；FM1-43染色、Neurobiotin神經(jīng)順行標(biāo)記技術(shù)以及P2X<

13、,2>免疫組織化學(xué)法均可以特異地顯示IGLEs的結(jié)構(gòu)，而FM1-43更能從功能上證實(shí)IGLEs是迷走神經(jīng)感受機(jī)械刺激的受體。IGLEs感受機(jī)械刺激的結(jié)構(gòu)屬于上皮鈉離子通道家族。炎癥可使直腸riGLEs的活性明顯增強(qiáng)，使直腸受牽拉刺激后機(jī)械敏感性通道的開放增多；這種對機(jī)械刺激的高敏感狀態(tài)在炎癥反應(yīng)消退后一定的時(shí)間內(nèi)可以持續(xù)存在。 2．炎癥可以使感受腸道內(nèi)傷害性刺激的脊髓背根神經(jīng)節(jié)初級感覺神經(jīng)元上CGRP和VR1的表達(dá)增高，而且可持

14、續(xù)至炎癥反應(yīng)消退后一定時(shí)間，導(dǎo)致胃腸道對多種刺激的敏感性異常增高，而組織學(xué)檢查并無異常。炎癥急性期也可使腸肌神經(jīng)叢CGRP和VR1的表達(dá)增高，但當(dāng)炎癥反應(yīng)消退后，其表達(dá)水平恢復(fù)正常。另外，CGRP和VR1在腸道以及支配腸道的脊髓DRG神經(jīng)元上存在著共表達(dá)。 3．機(jī)械及溫度覺受體TRPA1在食道、胃底、直腸以及支配直腸的脊髓初級傳入神經(jīng)元上均有表達(dá)，炎癥可以上調(diào)直腸組織以及支配直腸的DRG神經(jīng)元上TRPA1的表達(dá)，而且這種異常增高

15、的狀態(tài)可以持續(xù)存在至炎癥反應(yīng)消退后一定時(shí)間。 研究意義： 本研究通過建立實(shí)驗(yàn)性腸道炎癥模型，探討了炎癥介導(dǎo)的外周神經(jīng)致敏在內(nèi)臟敏感性增高發(fā)生中的作用及其機(jī)制。炎癥對支配腸道的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與異常修復(fù)，可以使腸道感受機(jī)械刺激、化學(xué)刺激、溫度刺激等有害性刺激的受體的表達(dá)異常增高，活性異常增強(qiáng)。炎癥對支配腸道的神經(jīng)系統(tǒng)損傷的遠(yuǎn)期效應(yīng)在功能性胃腸病的發(fā)病中具有重要的作用。這一機(jī)制提示我們在功能性胃腸病的預(yù)防和治療中，積極的抗感染