胃食管反流病內(nèi)臟高敏的外周機制的研究.pdf

1、研究目的
　　 目前研究發(fā)現(xiàn)食管痛覺高敏在GERD發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，GERD患者食管粘膜中的炎癥介質(zhì)可降低辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)、酸敏感離子通道3(acid-sensing ion channels 3，ASCI3)等酸敏感受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)閾值，從而介導(dǎo)外周致敏，引起食管粘膜的酸痛覺高敏現(xiàn)象，是50％以上GRED患者雖無過度酸反流，但仍

2、有典型反酸、燒心、胸骨后不適等癥狀的重要發(fā)病因素。而參與GERD患者食管痛覺高敏感形成的有關(guān)受體蛋白以及如何行有效的干預(yù)治療仍未明。
　　 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是疼痛領(lǐng)域的關(guān)注熱點，內(nèi)源性大麻素(anandamide，AEA)可通過分別激活大麻素受體1，2(cannabinoid receptor 1&2，CB1&CB2)或TRPV1受體在疼痛調(diào)控中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。但內(nèi)源性大麻素在食管痛覺高敏感形成和維持中機制未明。因此，本研究旨

3、在進(jìn)一步探討GERD的發(fā)病機制，擬明確內(nèi)源性大麻素AEA在NERD食管痛覺高敏中所發(fā)揮的作用及機制。
　　 研究方法
　　 雄性SD大鼠，體重200-250g。采用限制幽門及結(jié)扎胃底方法建立RE大鼠模型。假手術(shù)組大鼠開腹后分離胃底及幽門后即關(guān)腹。分別于術(shù)后7d、10d、15d取材食管下段組織，行蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色及病理評分來判斷食管粘膜損傷程度；統(tǒng)一于術(shù)后10d取材T1-T

4、3節(jié)段背根神經(jīng)節(jié)采用免疫熒光及Westernblot方法觀察TRPV1及CB1、CB2受體的表達(dá)變化，并將TRPV1、CB1、CB2的Westemblot結(jié)果行相關(guān)性分析。
　　 選擇SPSS16.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 研究結(jié)果
　　 1、慢性反流性食管炎大鼠模型的建立
　　 胃底結(jié)扎及幽門限制術(shù)可成功建立RE大鼠模型，并符合胃內(nèi)容物反流入食管刺激食管下段產(chǎn)生反流癥狀

5、的機制。術(shù)后15d取材發(fā)現(xiàn)，食管炎發(fā)生率為100％，組織學(xué)改變主要有：鱗狀上皮基底細(xì)胞增生明顯，基底層不同程度增厚，占整個鱗狀上皮厚度的16％以上(正常不超過15％)。粘膜固有層乳頭向上皮腔面延長，超過上皮厚度的2/3(正常不超過1/2)。固有層內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，早期為以中性粒細(xì)胞浸潤，伴纖維素形成；隨術(shù)后時間延長，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y表現(xiàn)，以淋巴細(xì)胞浸潤為主，粘膜下層小靜脈擴(kuò)張，毛細(xì)血管增多。食管鱗狀上皮細(xì)胞汽球樣變，胞漿淡染呈空泡狀，核

6、不規(guī)則或濃縮狀。對照組大鼠食管粘膜無明顯病理改變。
　　 2、TRPV1在RE大鼠的DRG及食管粘膜中表達(dá)上調(diào)
　　 造模后10d取材，蛋白定量檢測顯示RE組大鼠DRG中TRPV1蛋白表達(dá)上調(diào)，其相對于內(nèi)參GAPDH的灰度值為0.98±0.01，高于假手術(shù)組的0.64±0.09(P=0.001)。免疫熒光結(jié)果示TRPV1表達(dá)于DRG中的小直徑神經(jīng)元。高倍鏡下計數(shù)大鼠DRG中TRPV1表達(dá)的陽性百分比：RE組共計數(shù)2019

7、個神經(jīng)元，共有1608個神經(jīng)元表達(dá)陽性，陽性百分比為79.64％(72.11～87.69％)；假手術(shù)組共計數(shù)2643個神經(jīng)元，共計1026個陽性神經(jīng)元，陽性百分比為38.82％(36.00～41.84％)(P=0.000)，RE組大鼠TRPV1表達(dá)的陽性百分比高于假手術(shù)組。RE組大鼠DRG中TRPV1的累積熒光密度亦高于假手術(shù)組，分別為905.24±134.82，648.43±135.13(P=0.000)。
　　 蛋白定量檢測

8、顯示RE組大鼠食管粘膜中TRPV1蛋白表達(dá)上調(diào)，其相灰度值為0.92±0.06，高于假手術(shù)組的0.70±0.10(P=0.001)。免疫熒光結(jié)果示TRPV1免疫反應(yīng)陽性位于食管粘膜層乳頭結(jié)構(gòu)內(nèi)及粘膜下層。
　　 3、CB1、CB2在RE大鼠的DRG及食管粘膜中表達(dá)降低
　　 造模后10d取材，DRG中蛋白定量檢測顯示RE組大鼠CB1蛋白表達(dá)下調(diào)，其相對于內(nèi)參GAPDH的灰度值為0.86±0.05，假手術(shù)組為0.96±0.

9、06(P=0.013)。免疫熒光結(jié)果示CB1受體在DRG不同直徑神經(jīng)元均有陽性表達(dá)。高倍鏡下計數(shù)大鼠DRG中CB1表達(dá)的陽性百分比：RE組共計數(shù)1492個神經(jīng)元，共有1190個神經(jīng)元表達(dá)陽性，陽性百分比為60.25％(57.28～65.23％)；假手術(shù)組共計數(shù)1429個神經(jīng)元，共計1227個陽性神經(jīng)元，陽性百分比為82.24％(79.71～83.67％)(P=0.000)，RE組大鼠CB1表達(dá)的陽性百分比低于假手術(shù)組。RE組大鼠DRG中

10、CB1的累積熒光密度亦低于假手術(shù)組，分別為677.06±123.75，836.89±101.00(P=0.013)。
　　 食管粘膜中RE組大鼠的CB1蛋白表達(dá)降低，其相灰度值為0.76±0.03，假手術(shù)組為0.94.±0.04(P=0.000)。
　　 DRG中RE組大鼠的CB2蛋白表達(dá)下調(diào)，其相對于內(nèi)參GAPDH的灰度值為0.75±0.03，假手術(shù)組為0.81±0.05(P=0.019)。免疫熒光結(jié)果示CB2受體在D

11、RG大直徑神經(jīng)元表達(dá)陽性。高倍鏡下計數(shù)大鼠DRG中CB2表達(dá)的陽性百分比：RE組共計數(shù)1988個神經(jīng)元，共934個神經(jīng)元表達(dá)陽性，陽性百分比為46.98％(44.55～48.59％)；假手術(shù)組共計數(shù)1560個神經(jīng)元，共計1150個陽性神經(jīng)元，陽性百分比為73.72％(66.67～77.30％)(P=0.000)，RE組大鼠CB2表達(dá)的陽性百分比低于假手術(shù)組。RE組大鼠DRG中CB2的累積熒光密度亦低于假手術(shù)組，分別為513.99±79.

12、80,709.63±43.25(P=0.000)。
　　 食管粘膜中RE組大鼠的CB2蛋白表達(dá)亦降低，其相灰度值為0.80+0.17，假手術(shù)組為0.96±0.05(P=0.040)。
　　 TRPV1與CB1在RE大鼠DRG中呈負(fù)相關(guān)(r=-0.606，P=0.037)；在食管粘膜中蛋白表達(dá)亦負(fù)相關(guān)(r=-0.836，P=0.001)。
　　 結(jié)論
　　 1、“幽門限制加胃底結(jié)扎術(shù)”可成功建立慢性反流性食