SMYD3對雌激素代謝酶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用機制分析.pdf

1、組蛋白甲基化酶SMYD3(SET and MYND domain-containing protein3)是乳腺癌等癌癥中的重要調(diào)控因子，而雌激素信號通路的異?；钴S以及雌激素代謝產(chǎn)物亦與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，關(guān)于SMYD3在雌激素代謝中的作用，迄今為止尚未見有相關(guān)報道。鑒于此，本論文圍繞SMYD3對CYP1A1、CYP1B1兩種雌激素Ⅰ相代謝酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用機制，加以較為系統(tǒng)的研究，以期為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)防治療、合理用藥及

2、新藥研發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。
　　本文首先用不同濃度的17β-雌二醇(E2)對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)行處理，RT-PCR、Western blot分析發(fā)現(xiàn)CYP1A1、CYP1B1的表達(dá)量均可隨E2濃度的增加呈現(xiàn)劑量依賴性的上調(diào)。在采用RNA干擾特異性抑制內(nèi)源性SMYD3表達(dá)后，CYP1A1、CYP1B1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均進(jìn)一步顯著上升，同時高效液相色譜(HPLC)分析也證實細(xì)胞培養(yǎng)液中E2的殘留量隨之減少，而細(xì)胞內(nèi)E2代謝產(chǎn)物2OH-

3、E2及4OH-E2的產(chǎn)生量則相應(yīng)增多。此外，Real time RT-PCR及免疫組織化學(xué)分析表明SMYD3在乳腺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)量均明顯高于正常乳腺細(xì)胞及癌旁組織，而CYP1A1、CYP1B1的表達(dá)水平則與SMYD3的表達(dá)量呈明顯的負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明:SMYD3可下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中CYP1A1、CYP1B1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并因此抑制雌激素的Ⅰ相代謝反應(yīng)。
　　接下來，通過對CYP1A1、CYP1B1啟動子區(qū)域序列分析，發(fā)現(xiàn)二者均

4、含有多個SMYD3結(jié)合位點(SBE)。熒光素酶報告分析及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗結(jié)果顯示，SMYD3可與CYP1A1啟動子區(qū)-281位的SBE及CYP1B1啟動子區(qū)-21位的SBE結(jié)合，增強該區(qū)域的組蛋白H4K20甲基化修飾水平。將甲基化功能缺失的SMYD3突變體(SMYD3△NHSE)轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中后，Real time RT-PCR分析顯示SMYD3對CYP1A1的轉(zhuǎn)錄抑制作用基本解除，而對CYP1B1的轉(zhuǎn)錄抑制作用

5、則部分解除。表明SMYD3對CYP1A1的轉(zhuǎn)錄抑制作用主要是通過催化CYP1A1啟動子-281位SBE區(qū)域的組蛋白H4K20發(fā)生甲基化而產(chǎn)生的，而其對CYP1B1的轉(zhuǎn)錄抑制除了催化CYP1B1啟動子區(qū)-21位SBE區(qū)域的組蛋白H4K20甲基化外，還存在其它機制。
　　結(jié)合本課題組前期的miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在CYP1B1的3'UTR中存在有SMYD3下游靶基因miR-200c的結(jié)合位點(MRE)，利用熒光素