黃芩苷上調(diào)FUT4表達(dá)及促進(jìn)胚胎著床機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的:
　　1.糖基化在決定子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的容受能力方面發(fā)揮重要作用。
　　2.巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ(FUT4)在哺乳動(dòng)物子宮內(nèi)膜呈階段特異性表達(dá)，并被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物。
　　3.黃芩苷(Baicalin)是從中藥黃芩（Scutellaria Baicalensis）中提取的一種黃酮類單體，具有改善哺乳動(dòng)物生殖的功能。
　　4.然而，黃芩苷在胚胎與子宮內(nèi)膜黏附過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用是否與子宮內(nèi)膜FUT4表達(dá)

2、有關(guān)目前尚不清楚。
　　5.本研究旨在探討黃芩苷對(duì)胚胎黏附和著床的影響及其糖生物學(xué)作用機(jī)制，進(jìn)一步揭示黃芩苷對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎著床的重要調(diào)控作用。
　　方法:
　　1.利用RT-PCR，Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)黃芩苷對(duì)人子宮內(nèi)膜RL95-2細(xì)胞FUT4 mRNA和蛋白表達(dá)影響。
　　2.采用Western blot技術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照（control）、二甲基亞砜(DMSO)、黃芩苷(baicalin)

3、、Dickkopf1(DKK1)、黃芩苷聯(lián)合DKK1、轉(zhuǎn)染對(duì)照(vector)、β-連環(huán)蛋白干擾(si-β-catenin)、黃芩苷聯(lián)合si-β-catenin等8組Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵分子磷酸化糖原合成激酶3β(p-GSK3β)，GSK3β，β-catenin和特異蛋白5(SP5)表達(dá)水平。
　　3.為探究SP5如何調(diào)節(jié)FUT4表達(dá)，我們應(yīng)用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)sh-SP5，SP1-c

4、DNA及其共轉(zhuǎn)染對(duì)RL95-2細(xì)胞FUT4 mRNA和蛋白表達(dá)影響。
　　4.利用子宮內(nèi)膜RL95-2細(xì)胞和胚胎JAR細(xì)胞共培養(yǎng)建立的體外植入模型，檢測(cè)了包括正常對(duì)照、DMSO、baicalin(3，6μg/mL)、sh-SP5等15組的胚胎黏附率。
　　5.采用RT-PCR，Western blot和免疫組化技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)經(jīng)黃芩苷和黃芩水煎液灌胃處理的昆明小鼠在孕第4天子宮內(nèi)膜SP5和FUT4 mRNA和蛋白表達(dá)情況。

5、r>　　6.孕第8天計(jì)算正常對(duì)照、生理鹽水、黃芩苷和黃芩水煎液組的小鼠胚胎著床數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.黃芩苷促進(jìn)入子宮內(nèi)膜細(xì)胞FUT4 mRNA和蛋白表達(dá)。RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，黃芩苷3μg/mL(P＜0.05)和6μg/mL（P＜0.01）能顯著提高RL95-2細(xì)胞FUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平;免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR和Westernblot一致。
　　2.黃芩苷活化人子宮內(nèi)膜

6、細(xì)胞Wnt/β-catenin/SP5信號(hào)通路。Westem blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，黃芩苷（6μg/mL）能顯著提高RL95-2細(xì)胞p-GSK3β，β-catenin和SP5(P＜0.001)的表達(dá)水平;同時(shí)，黃芩苷能夠恢復(fù)DKK1和β-cateninsiRNA預(yù)處理的RL95-2細(xì)胞p-GSK3β，β-catenin和SP5的表達(dá)水平。
　　3.SP5上調(diào)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞FUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平。RT-PCR

7、和Westernblot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，sh-SP5(P＜0.001)、SP1-cDNA(P＜0.01)和共轉(zhuǎn)染(P＜0.001)組FUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。
　　4.黃芩苷通過(guò)Wnt/β-catenin/SP5信號(hào)通路上調(diào)FUT4表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞與胚胎細(xì)胞的黏附。黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照、DMSO、sh-control和mock組之間的胚胎黏附率無(wú)顯著性差異;與對(duì)照組和DMSO組相比，黃芩苷能顯著

8、提高RL95-2細(xì)胞的胚胎黏附率;與轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，sh-SP5或SP1-cDNA(P＜0.001)能顯著降低RL95-2細(xì)胞的胚胎黏附率;同時(shí)，黃芩苷能夠恢復(fù)sh-SP5或SP1-cDNA預(yù)處理的RL95-2細(xì)胞的胚胎黏附率，但仍低于黃芩苷組;黃芩苷顯著增加共轉(zhuǎn)染組胚胎黏附率;進(jìn)一步研究表明，黃芩苷能夠顯著反轉(zhuǎn)FUT4 siRNA導(dǎo)致的低胚胎黏附率。
　　5.黃芩苷促進(jìn)著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜SP5及FUT4 mRNA和蛋白表達(dá)。

9、RT-PCR和Western blot揭示，與正常對(duì)照和生理鹽水組比較，黃芩苷和黃芩水煎液能顯著增加孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜FUT4和SP5 mRNA及蛋白表達(dá)水平;同時(shí)，免疫組化結(jié)果顯示，黃芩水煎液組與正常對(duì)照組相比免疫染色較強(qiáng)，與黃芩苷組相比免疫染色較弱。
　　6.黃芩苷提高小鼠妊娠成功率。與正常對(duì)照和生理鹽水組比較，黃芩苷(P＜0.01)和黃芩水煎液(P＜0.05)組胚胎著床率顯著增加。
　　結(jié)論:
　　1.黃芩苷上