紅霉素預(yù)適應(yīng)對腦低氧損傷的保護作用及其機制的研究.pdf

1、目的：
　　預(yù)適應(yīng)的概念是指一次或多次比較短暫的輕度刺激，可觸發(fā)機體產(chǎn)生內(nèi)源性的保護反應(yīng)，繼而機體對隨后發(fā)生的比較嚴重的刺激產(chǎn)生耐受，預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象是機體的一種重要的自我保護機制。預(yù)適應(yīng)這種現(xiàn)象在神經(jīng)外科以及其他各領(lǐng)域都有廣闊的臨床應(yīng)用前景。在神經(jīng)外科開顱手術(shù)過程中，特別是在一些顱內(nèi)動脈瘤的手術(shù)過程中，手術(shù)時經(jīng)常會短時間夾閉一些血管，從而可能造成一些神經(jīng)細胞的短時性缺血缺氧損傷。如果我們能較好的利用預(yù)適應(yīng)的機體保護作用，就可以在一定程

2、度上提高患者對動脈瘤手術(shù)的耐受程度，進而減少手術(shù)可能出現(xiàn)的并發(fā)癥和后遺癥，從而提高疾病的預(yù)后。合理利用預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象的機體保護作用將產(chǎn)生比較重大的社會和經(jīng)濟效益。預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象對機體的保護作用不僅能體現(xiàn)在缺血性損傷中，它還可能對別的損傷也起到一定的保護的作用;與此同時能夠誘發(fā)預(yù)適應(yīng)的保護作用產(chǎn)生的因子也不僅是缺血性損傷，還有許多其他的因素也可以誘發(fā)預(yù)適應(yīng)的保護作用。進一步研究預(yù)適應(yīng)對機體的保護作用具有比較誘人的臨床應(yīng)用前景。
　　預(yù)適應(yīng)可

3、以根據(jù)誘發(fā)其產(chǎn)生的因子的不同將其分為缺血性預(yù)適應(yīng)和化學(xué)性預(yù)適應(yīng)，化學(xué)性預(yù)適應(yīng)的概念是指利用某些可以干擾細胞能量代謝的化學(xué)物質(zhì)，誘發(fā)產(chǎn)生細胞缺氧改變從而誘導(dǎo)產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)的保護作用的一種方法。紅霉素是目前臨床上比較常用的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥，目前已有研究證實紅霉素可以干擾細胞內(nèi)線粒體的能量代謝進而模擬缺血的產(chǎn)生從而誘發(fā)預(yù)適應(yīng)。最近，以Ansgar M.等人為首的研究團隊證實了紅霉素預(yù)適應(yīng)可以在鼠全腦缺血模型中，通過模擬缺血缺氧的產(chǎn)生從而誘導(dǎo)產(chǎn)

4、生預(yù)適應(yīng)進而對腦產(chǎn)生保護作用。為了更進一步探索紅霉素預(yù)適應(yīng)的保護作用，我們試圖通過建立紅霉素預(yù)適應(yīng)的體外模型和動物模型，明確紅霉素預(yù)適應(yīng)是否可以對pc-12細胞低氧損傷及大鼠局灶性腦缺血產(chǎn)生保護作用，并通過對神經(jīng)型一氧化氮合酶、低氧誘導(dǎo)因子-1α等相關(guān)因子的分子生物學(xué)檢測從而對紅霉素預(yù)適應(yīng)的可能機制進行進一步的探索和研究。
　　方法:
　　一、紅霉素預(yù)適應(yīng)對pc-12細胞低氧損傷的保護作用及其機制的初步研究
　?。ㄒ唬?/p>

5、實驗材料
　　1.主要試劑
　　紅霉素、DMEM培養(yǎng)液、無糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、谷氨酰胺、明膠、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、葡聚糖。羊抗兔IgG多克隆抗體，兔抗β-actin多克隆抗體，兔抗nNOS多克隆抗體，兔抗HIF-1α多克隆抗體，ECL試劑盒，TRIzol，RT-PCR反應(yīng)采用TaKaRa公司的RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0試劑盒。
　　2.主要儀器
　　水浴箱、離心機、二氧化碳培養(yǎng)箱、

6、超凈工作臺、倒置顯微鏡、低氧培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡。
　?。ǘ嶒灧椒?br>　　1.pc-12細胞的培養(yǎng)
　　2.pc-12細胞的低氧培養(yǎng)及氧糖剝奪預(yù)處理
　　3.MTT法測定細胞增殖;
　　4.流式細胞儀PI染色檢測細胞凋亡;
　　5.RT-PCR法檢測pc-12細胞中nNOS和HIF-1α的mRNA含量的變化
　　6.Western-blot法檢測pc-12細胞中nNOS和HIF-1α蛋白含量的變

7、化
　　二、紅霉素預(yù)適應(yīng)對大鼠MCAO模型腦組織的保護作用及其機制的研究
　?。ㄒ唬嶒灢牧?br>　　1.動物:成年雄性Wistar大鼠（270-300g）購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心
　　2.主要試劑:紅霉素、紅四氮唑，羊抗兔IgG多克隆抗體，兔抗β-actin多克隆抗體，兔抗nNOS多克隆抗體，兔抗HIF-1α多克隆抗體，ECL試劑盒，TRIzol，TaKaRa公司的RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.

8、0試劑盒。
　　3.主要儀器:分光光度計，電泳儀，轉(zhuǎn)印儀，離心機，冰箱。
　?。ǘ嶒灧椒?br>　　1.紅霉素預(yù)處理Wistar大鼠。
　　2.線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型(MCAO)。
　　3.干濕法測定腦組織含水量
　　4.TTC染色測定腦缺血面積
　　5.大鼠神經(jīng)功能評分
　　6.RT-PCR法檢測腦組織中nNOS和HIF-1α的mRNA含量的變化
　　7.Weste

9、rn-blot法檢測腦組織中nNOS和HIF-1α蛋白含量的變化
　　結(jié)果:
　　一、紅霉素預(yù)適應(yīng)對pc-12細胞低氧損傷的保護作用及其機制的初步研究
　　1.紅霉素預(yù)適應(yīng)對細胞增殖的影響:紅霉素預(yù)適應(yīng)各組與低氧對照組相比可見紅霉素預(yù)適應(yīng)明顯提高細胞的增殖，其中以400 mmol/L紅霉素預(yù)處理組效果最為明顯(p＜0.01)。
　　2.紅霉素預(yù)適應(yīng)對細胞凋亡的影響:PI染色流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果提示:400

10、mmol/L紅霉素預(yù)處理組與低氧培養(yǎng)對照組相比紅霉素預(yù)適應(yīng)可以明顯減少細胞凋亡(p＜0.01)。
　　3.細胞中nNOS的mRNA含量及蛋白含量的變化:400mmol/L紅霉素預(yù)適應(yīng)組與低氧培養(yǎng)對照組相比nNOS的mRNA及蛋白含量均明顯增高(p＜0.01)。
　　4.細胞中HIF-1α的mRNA含量及蛋白含量的變化:400 mmol/L紅霉素預(yù)適應(yīng)組與低氧培養(yǎng)對照組相比HIF-1α的mRNA含量及蛋白含量明顯降低(p＜0.

11、01)。
　　二、紅霉素預(yù)適應(yīng)對大鼠MCAO模型腦組織的保護作用及其機制的研究
　　1.紅霉素預(yù)適應(yīng)對腦梗死體積的影響:假手術(shù)組中無梗死產(chǎn)生。與缺血再灌注組相比紅霉素預(yù)處理E-3h和E-48h組沒有顯著性差異(P＞0.05)，而紅霉素預(yù)處理E-6h，E-12h，E-24h組與缺血再灌注組相比梗死體積均明顯降低(P＜0.05,P＜0.01，和P＜0.05)。
　　2.腦水腫測定結(jié)果:紅霉素預(yù)處理E-12h組與缺血再灌注組

12、相比，能明顯降低缺血側(cè)腦水腫(P＜0.05)，而非缺血側(cè)的腦組織的含水量變化差異無顯著性(P＞0.05)。
　　3.神經(jīng)功能評分的比較:紅霉素預(yù)處理E-12h組與單純MCAO對照組相比在術(shù)后4天到7天可以明顯提高大鼠神經(jīng)功能評分(P＜0.05)。
　　4.腦組織中nNOS的mRNA含量及蛋白含量的變化:紅霉素預(yù)處理E-6h組，E-12h組，E-24h組與單純MCAO對照組相比nNOS的mRNA及蛋白含量明顯增高(P＜0.05

13、，P＜0.01，P＜0.05)。
　　5.腦組織中HIF-1α的mRNA含量及蛋白含量的變化:紅霉素預(yù)處理E-3h組，E-6h組，E-12h組，E-24h組與單純MCAO對照組相比，HIF-1α的mRNA含量及蛋白含量明顯降低(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、紅霉素預(yù)適應(yīng)對PC-12細胞低氧損傷及大鼠MCAO產(chǎn)生的損傷具有保護作用，能明顯減少細胞凋亡并且降低腦缺血后的腦梗