NRF-1在紅霉素預(yù)適應(yīng)大鼠局灶性腦缺血中的表達(dá)變化及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：
　　 腦缺血預(yù)適應(yīng)是指通過對(duì)腦一次或多次短暫的非致死性缺血損傷后,可觸發(fā)機(jī)體啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制繼而對(duì)隨后的長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷產(chǎn)生耐受性,是機(jī)體的一種重要保護(hù)機(jī)制[1]。目前,對(duì)紅霉素這種臨床常用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究越來愈多,Ansgar M等人證實(shí)了紅霉素預(yù)適應(yīng)在大鼠全腦缺血模型中通過模擬缺血缺氧誘導(dǎo)對(duì)腦組織的保護(hù)作用[2]。Koerner IP[3]等人發(fā)現(xiàn)了紅霉素誘導(dǎo)缺血耐受可以改編腦缺血組織轉(zhuǎn)錄程序并且抑制炎癥反應(yīng)

2、,有研究表明紅霉素可以干擾線粒體能量代謝從而模擬缺血從而誘發(fā)適應(yīng)的[4-7],本研究旨在證實(shí)NRF-1在紅霉素預(yù)適應(yīng)中表達(dá)增強(qiáng),與預(yù)適應(yīng)的機(jī)制關(guān)系密切,并參與干擾線粒體的呼吸鏈。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法探討NRF-1與紅霉素缺血預(yù)適應(yīng)之間的定性關(guān)系,研究其與呼吸鏈的相關(guān)性。
　　 材料與方法：
　　 一、材料：
　　 成年雄性SPF級(jí)Wistar大鼠(280-310g)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;乳糖酸紅霉素購(gòu)自

3、大連美羅制藥廠;免疫組化用Rabbit anti-NRF-1抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗(1:500),二步法免疫組化試劑盒(PV29000);DAB顯色劑。
　　 二、紅霉素預(yù)處理和實(shí)驗(yàn)分組：
　　 我們將大鼠隨機(jī)分為6組(n=6),分別為:對(duì)照組;缺血組;紅霉素組;紅霉素+缺血組;紅霉素+7NI(7-nitroindazole)組;紅霉素+缺血+7NI組。對(duì)照組未予特殊處置

4、,缺血組為無(wú)預(yù)適應(yīng)單純?nèi)毖?紅霉素組在缺血前12小時(shí)給109PD肌肉注射乳糖酸紅霉素(25mg/kg)預(yù)適應(yīng),紅霉素+7NI組為給予肌肉注射乳糖酸紅霉素(25mg/kg)和7NI(50mg/kg)預(yù)適應(yīng),紅霉素+缺血+7NI組為缺血前12小時(shí)給予肌肉注射乳糖酸紅霉素(25mg/kg)和7NI(50mg/kg)預(yù)適應(yīng)。
　　 三、大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型(MCAO)的建立：
　　 大鼠腹腔注射10％水合氯醛(350m

5、g/kg)麻醉,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(commoncarotid artery,CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)頸外動(dòng)脈(external carotidartery,ECA),結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端,在CCA遠(yuǎn)端近分叉處剪口,插入直徑0.26mm的尼龍線使其由ICA入顱致大腦中動(dòng)脈近端,阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。在缺血2小時(shí)后將尼龍線拔出形成再灌注,持續(xù)觀察24小時(shí),取腦固定。
　　 四、腦梗死體積

6、測(cè)定(TTC染色)：
　　 將6個(gè)分別取5只大鼠斷頭取腦,缺血組再灌注24小時(shí)后斷頭取腦,取出的腦組織至于-20℃冰箱快速冰凍20分鐘,從額極開始每隔2mm冠狀切取腦組織5片,置于2％TTC中,37℃水浴避光孵育30分鐘,計(jì)算腦梗死體積百分比。參考Shrimakura的方法減少水腫對(duì)梗死體積的影響即梗死體積(％)=[LV-(RV-MV)]/RV×100％,其中MV是總梗死體積,LV,RV分別是左右半球的梗死體積。
　　

7、五、免疫組化染色：
　　 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)紅霉素預(yù)適應(yīng)大鼠局灶性腦缺血模型中NRF-1的表達(dá)情況。取一組先行HE染色做比照,再行免疫組化。以海馬區(qū)細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆?；蚓咀睾稚x為陽(yáng)性。對(duì)于每張切片計(jì)數(shù)其陽(yáng)性百分率,無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為(-),(+)為陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)的≥5％,(++)為陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)的5％-25％,(+++)為陽(yáng)性細(xì)胞占總數(shù)25％-50％,(++++)為陽(yáng)性細(xì)胞≥總數(shù)的50％。
　　 六、統(tǒng)計(jì)方法：

8、>　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,數(shù)據(jù)進(jìn)t檢驗(yàn),p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、腦梗死體積的比較：
　　 腦組織TTC染色后,正常組織染成紅色,梗死灶染成白色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大腦中動(dòng)脈缺血再灌注后,梗死灶位于右側(cè)額、顳、頂部皮質(zhì)區(qū)以及新紋狀體外側(cè)部。紅霉素缺血組與單純?nèi)毖M相比梗死面積明顯減小,有顯著差異(p＜0.05)

9、,紅霉素+7NI+缺血組與單純?nèi)毖M相比缺血面積有所減少,但統(tǒng)計(jì)學(xué)未見顯著差異p＞0.05)。紅霉素+7NI+缺血組與紅霉素缺血組相比梗死面積增加,有顯著差異p＜0.05)。
　　 二、免疫組織化學(xué)染色：
　　 (1)nNOS染色陽(yáng)性表現(xiàn)為皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)著黃色,在紅霉素缺血預(yù)適應(yīng)組表達(dá)強(qiáng)烈。陽(yáng)性率高[20],與單純?nèi)毖M和紅霉素組相比有顯著差異(p＞0.05),并且可以被7NI阻斷。
　　 (2)NRF-1染

10、色陽(yáng)性表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)有棕褐色著色,尤其在紅霉素預(yù)適應(yīng)缺血腦組織表達(dá)強(qiáng)烈,陽(yáng)性率為40.83％,在紅霉素組和缺血組分別為20.70％和24.82％。在對(duì)照組陽(yáng)性率為14.03％,與紅霉素組相比表達(dá)陽(yáng)性率有顯著差異(p＜0.05),與紅霉素缺血組相比(t=3.8779,p＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、紅霉素預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠局灶性急性腦缺血損傷具有保護(hù)作用,能明顯減少腦缺血后腦梗死體積。
　　 2、NRF-