基于大鼠睪丸細(xì)胞三維共培養(yǎng)模型的雄性生殖毒性測(cè)試系統(tǒng)建立.pdf

1、目的：
　　生殖和發(fā)育功能障礙是當(dāng)前嚴(yán)重影響人體健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一?，F(xiàn)行各類(lèi)化合物的生殖毒性評(píng)價(jià)主要采用整體動(dòng)物試驗(yàn)方法，但以整體動(dòng)物為基礎(chǔ)的生殖毒性測(cè)試評(píng)價(jià)方法不符合“3R”原則，不能完全滿(mǎn)足安全性或危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)發(fā)展的需求。建立更好地吸收融合現(xiàn)代生物技術(shù)、能提供更多機(jī)制信息、能轉(zhuǎn)化應(yīng)用于人體的體外毒性測(cè)試評(píng)價(jià)方法成為發(fā)展趨勢(shì)。睪丸是外源性化合物雄性生殖毒性最敏感的器官，雄性生殖的主要功能精子發(fā)生和性激素的生成也由睪丸完成。

2、因此，睪丸成為建立雄性生殖毒性體外測(cè)試方法時(shí)優(yōu)先考慮的器官。目前國(guó)內(nèi)外已建立了多種睪丸細(xì)胞體外毒性測(cè)試方法，存在的主要問(wèn)題包括，單個(gè)細(xì)胞的試驗(yàn)只能對(duì)該細(xì)胞的特異毒性及其機(jī)制進(jìn)行研究，難以作為睪丸毒性的評(píng)價(jià)方法;尚不能觀察對(duì)生精細(xì)胞分化即精子生成的影響。因此，建立能涵蓋睪丸主要細(xì)胞Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞和生精細(xì)胞功能，特別是能觀察生精細(xì)胞分化的研究模型成為近年來(lái)研究努力的方向。
　　近年來(lái)，在睪丸細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域取得兩項(xiàng)

3、重要進(jìn)展，一是用細(xì)胞外基質(zhì)作為支架成功實(shí)現(xiàn)了能更好維持睪丸主要體細(xì)胞功能的三維短期共培養(yǎng);二是發(fā)現(xiàn)血清替代物(knockOut serum replacement，KSR)能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞和精原細(xì)胞的增殖及精原細(xì)胞向初級(jí)精母細(xì)胞分化。基于此，我們推測(cè)如將兩項(xiàng)成果加以綜合，加之培養(yǎng)條件的優(yōu)化，有可能建立穩(wěn)定的既能觀察睪丸主要體細(xì)胞功能，又能觀察生精細(xì)胞分化功能的研究模型。本研究的思路是擬采用細(xì)胞外基質(zhì)作為3D培養(yǎng)支架，以KSR作為血清替

4、代物，對(duì)睪丸Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞和生精細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng);再通過(guò)選擇比較不同的培養(yǎng)方式、延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間、優(yōu)化培養(yǎng)條件，建立既能觀察Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞功能變化，又可以觀察精原細(xì)胞分化的大鼠睪丸細(xì)胞三維共培養(yǎng)模型;然后研究其作為睪丸體外毒性測(cè)試系統(tǒng)的適用性。目的是為建立既可作為評(píng)價(jià)各類(lèi)化學(xué)物對(duì)大鼠睪丸主要體細(xì)胞功能影響，還可觀察對(duì)精子發(fā)生影響、能提供更多毒作用機(jī)制信息的大鼠睪丸體外毒性測(cè)試系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。
　

5、　方法：
　　1、大鼠睪丸細(xì)胞3D共培養(yǎng)模型的建立:選擇6日齡SD大鼠，處死取出睪丸，清洗去白膜，經(jīng)過(guò)系列酶消化獲得細(xì)胞懸浮液，經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾，用臺(tái)盼藍(lán)鑒定存活率，以原比例混合共培養(yǎng)方式在37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。獲取細(xì)胞當(dāng)天為d0。采用細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)作為三維支架，KSR作為常規(guī)胎牛血清FBS的替代物，以細(xì)胞增殖能力、睪酮含量、乳酸鹽分泌量和生精細(xì)胞減數(shù)分裂特異性基因St

6、ra8和Sycp3作為該模型初步成功與否的判斷指標(biāo)。通過(guò)對(duì)不同濃度的ECM和HCG、不同密度的細(xì)胞、不同日齡的乳鼠，不同時(shí)長(zhǎng)的共培養(yǎng)周期的比較確定適宜的實(shí)驗(yàn)條件。為評(píng)價(jià)共培養(yǎng)模型的效果，與采用常規(guī)胎牛血清的3D共培養(yǎng)方式(FBS+ECM)和未采用ECM的2D共培養(yǎng)方式(KSR-ECM)進(jìn)行比較。
　　2、大鼠睪丸細(xì)胞3D共培養(yǎng)模型作為雄性生殖毒性測(cè)試系統(tǒng)適用性的初步驗(yàn)證:選用歐洲替代方法驗(yàn)證中心推薦的雙酚A(BiphoneA，BP

7、A)和鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate，DBP)作為陽(yáng)性物，觀察不同作用時(shí)間（8、16和24天）和暴露濃度（BPA:0、17.85、37.5和75μM; DBP:0、6.25、12.5和25μM）驗(yàn)證該模型作為毒性測(cè)試系統(tǒng)的可行性。
　　3、新藥HZ1006長(zhǎng)期毒性研究和基于大鼠睪丸細(xì)胞3D共培養(yǎng)模型的睪丸毒性研究:對(duì)新藥(代號(hào)為HZ1006)進(jìn)行SD大鼠和Beagle犬的28天長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，大鼠:20、60和

8、120 mg/kg，犬:20、40和80 mg/kg，經(jīng)口給藥，連續(xù)28天，恢復(fù)期大鼠2周，犬4周。選擇HZ1006不同暴露時(shí)間（8、16和24天）和暴露濃度（0、3.125、6.25、12.5和25μM），采用所建測(cè)試系統(tǒng)對(duì)HZ1006潛在的體外雄性生殖毒性及其作用機(jī)制進(jìn)行應(yīng)用研究。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠睪丸細(xì)胞3D共培養(yǎng)模型的建立:結(jié)果顯示睪丸細(xì)胞分離存活率在95％以上，三種主要細(xì)胞維持了良好的生長(zhǎng)增殖情況，從乳酸鹽

9、、睪酮分泌量和生精細(xì)胞分化情況來(lái)看，睪酮和乳酸鹽分泌量30天穩(wěn)定，生精細(xì)胞d24-d26期間內(nèi)開(kāi)始檢測(cè)到了減數(shù)分裂特異標(biāo)志，顯示培養(yǎng)物在共培養(yǎng)期間三種主要細(xì)胞不僅生長(zhǎng)良好，而且保持了良好的細(xì)胞功能。培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果顯示200μg/ml的細(xì)胞外基質(zhì)濃度、5×105/ml的細(xì)胞密度、10 IU/ml HCG，出生后6天的乳鼠和26天的培養(yǎng)周期被確定為適宜的實(shí)驗(yàn)條件。與FBS+ECM的3D共培養(yǎng)和KSR-ECM的2D共培養(yǎng)方式比較結(jié)果顯示，本

10、試驗(yàn)培養(yǎng)方式的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞之間形成緊密連接;睪酮和乳酸鹽分泌量明顯提高且分泌較為穩(wěn)定;在d24-d26期間開(kāi)始檢測(cè)到了生精細(xì)胞第一次減數(shù)分裂特異標(biāo)志（Sycp3和Stra8基因和蛋白）。
　　2、大鼠睪丸細(xì)胞3D共培養(yǎng)模型作為雄性生殖毒性測(cè)試系統(tǒng)適用性的初步驗(yàn)證:結(jié)果顯示BPA和DBP可抑制睪酮的分泌，BPA和DBP對(duì)睪酮分泌量的影響具有明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。不同濃度BPA和DBP對(duì)類(lèi)固醇激素合成相關(guān)基因

11、Star的表達(dá)水平也有明顯影響，隨著濃度增加Star基因和蛋白表達(dá)量下降，有明顯的劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。BPA和DBP可使乳酸鹽分泌量下降，對(duì)乳酸鹽分泌量的影響具有明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。不同濃度的BPA和DBP對(duì)雄激素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(Abp)的基因和蛋白表達(dá)水平有明顯影響，隨著濃度增加Abp表達(dá)量下降，有明顯的劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。不同濃度BPA和DBP作用24天后，可對(duì)生精細(xì)胞減數(shù)分裂特異性基因Stra8和Sycp3的表達(dá)造成不同程度的影響，對(duì)S

12、tra8和Sycp3基因和蛋白表達(dá)的抑制作用有明顯的劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。結(jié)果還顯示，BPA最敏感的靶細(xì)胞是Sertoli細(xì)胞，可能首先引起Sertoli細(xì)胞功能改變，而DBP最敏感的靶細(xì)胞是Leydig細(xì)胞，可能首先引起Leydig細(xì)胞功能改變，進(jìn)而影響其他生殖細(xì)胞功能。
　　3、新藥HZ1006長(zhǎng)期毒性研究和基于大鼠睪丸細(xì)胞3D共培養(yǎng)模型的睪丸毒性研究:40mg/kg以上劑量的HZ1006可引起犬雄性生殖毒性，表現(xiàn)為睪丸、附睪和前列

13、腺的病理改變。其中睪丸的病理改變包括生精小管管腔偏小，數(shù)量也較少，生精細(xì)胞層次單一，數(shù)量明顯減少，只能見(jiàn)到精原細(xì)胞和部分初級(jí)精母細(xì)胞，次級(jí)精母細(xì)胞、各級(jí)精細(xì)胞、成熟精子罕見(jiàn)。但大鼠未觀察到明顯的雄性生殖毒性。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HZ1006對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞24 h、48 h和72 h的細(xì)胞毒性(IC50)分別為325.19、277.17和149.64μM。HZ1006抑制細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響有一定時(shí)間和劑量依賴(lài)性。HZ1006可抑制

14、睪酮的分泌，對(duì)睪酮分泌量的影響具有明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。不同濃度HZ1006作用24天后，可對(duì)生精細(xì)胞減數(shù)分裂特異性基因Stra8和Sycp3的表達(dá)造成不同程度的影響，對(duì)Stra8和Sycp3基因和蛋白表達(dá)的抑制作用有明顯的劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。試驗(yàn)還觀察到HZ1006可致AR蛋白水平及其靶向基因PSA表達(dá)水平的下降，Hdac6表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　1、成功建立了既能觀察Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞功能變化，又可以

15、觀察生精細(xì)胞增殖分化，可作為研究大鼠睪丸主要細(xì)胞生物學(xué)功能的3D體外共培養(yǎng)模型。目前國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。
　　2、驗(yàn)證結(jié)果顯示大鼠睪丸細(xì)胞3D共培養(yǎng)模型可有效檢測(cè)出BPA和DBP對(duì)雄性睪丸細(xì)胞已知的各類(lèi)毒作用，并可更準(zhǔn)確地確定靶細(xì)胞等，為機(jī)制研究提供更多信息。初步表明該模型可作為雄性生殖毒性的測(cè)試系統(tǒng)及其毒作用機(jī)制的研究模型。
　　3、新藥HZ1006在40mg/kg以上劑量經(jīng)口給藥可引起犬雄性生殖毒性，表現(xiàn)為睪丸、附睪和前列腺

16、的病理改變。但對(duì)大鼠未觀察到明顯的雄性生殖毒性。HZ1006在體外可導(dǎo)致睪丸毒性，這與長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中HZ1006犬睪丸毒性結(jié)果是一致的，其作用靶細(xì)胞可能是Leydig細(xì)胞，由于影響睪酮分泌，進(jìn)而影響精子生成。初步的機(jī)制研究提示HZ1006引起的生殖毒性改變可能與其對(duì)Hdac6的抑制作用有關(guān)，表現(xiàn)為AR蛋白水平的降低及其靶向基因水平的下降。研究結(jié)果為HZ1006的毒性評(píng)價(jià)和機(jī)制研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù);也證實(shí)了所建模型作為雄性生殖毒性測(cè)試系