以膠原水凝膠為支架體外構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng).pdf

1、【背景】:急性肝衰竭病程進展迅速,病死率高,肝移植被認為是唯一有效的治療手段,但供肝嚴重缺乏。人工肝支持系統(tǒng)可有效替代急性肝衰竭患者的肝臟功能,為肝細胞再生及等待肝源提供時間,協(xié)助患者順利度過肝衰期,最終降低肝衰竭患者死亡率。近年來,多種生物人工肝(BAL)相繼被研發(fā)并在臨床應(yīng)用,因不僅具有解毒作用,還有肝細胞的合成、代謝功能,在肝衰竭治療上顯示出極大的優(yōu)越性。但目前研發(fā)的BAL尚不能充分模擬體內(nèi)肝臟微環(huán)境,肝細胞在體外培養(yǎng)及治療過程中

2、易失去活性及功能,嚴重影響治療效果。因此,改善肝細胞培養(yǎng)體系,使BAL中肝細胞長期維持活性及功能是達到理想治療效果的關(guān)鍵。膠原水凝膠支架因含水量高、氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物容易運輸、液固轉(zhuǎn)換、生物相容性好、制作工藝簡單以及易于交聯(lián)可溶性生長因子等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于細胞三維培養(yǎng),前期結(jié)果也證實將肝細胞在膠原水凝膠中三維培養(yǎng)可顯著延長其白蛋白及尿素分泌水平。而將肝細胞與其它細胞共培養(yǎng)也可顯著促進肝功能維持。因此,本文聯(lián)合三維培養(yǎng)、添加生長因子

3、及共培養(yǎng)三種方式促進肝細胞功能維持,將肝細胞及NIH/3T3成纖維細胞接種于預混肝細胞生長因子(HGF)的膠原水凝膠中構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng),并對此培養(yǎng)體系進行進一步優(yōu)化及功能驗證,為構(gòu)建有效的BAL奠定基礎(chǔ)。
　　【目的】:聯(lián)合使用膠原水凝膠、HGF及NIH/3T3成纖維細胞體外構(gòu)建能夠長時間有效維持肝細胞活性及功能的肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)。
　　【方法】:(1)將SD大鼠原代肝細胞及NIH/3T3成纖維細胞與預混HGF及

4、DMEM的液態(tài)I型膠原混合構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng),通過相差顯微鏡、HE染色、糖原(PAS)染色、免疫熒光染色等方法對培養(yǎng)肝細胞的形態(tài)、表型、白蛋白及糖原合成功能進行初步檢測。(2)為進一步優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng),在膠原水凝膠支架中分別混合五種不同比例的肝細胞與NIH/3T3成纖維細胞(H:F為1:0.5、1:1、1:2、1:4及1:8)、接種四種不同濃度的細胞混懸液(2×104/mL,2×105/mL,2×106/mLand2×107/ml)后

5、連續(xù)培養(yǎng)25天,收集培養(yǎng)液上清,比較各組中肝細胞的白蛋白及尿素合成水平變化,篩選出最佳的培養(yǎng)條件,然后采用三種不同培養(yǎng)方式(單獨培養(yǎng),插入培養(yǎng),共培養(yǎng))進行培養(yǎng),評估共培養(yǎng)細胞之間的直接接觸作用或間接作用,從而確定最佳的培養(yǎng)方式。(3)使用最優(yōu)化條件構(gòu)建肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)后連續(xù)培養(yǎng)肝細胞25天,在不同時間點通過LIVE/DEAD染色、WST-1試驗檢測細胞活性,并對肝細胞功能維持(白蛋白及尿素分泌、LDL攝取)、肝細胞特異基因表達水平

6、等進行檢測。
　　【結(jié)果】:(1)肝細胞/膠原水凝膠復合物呈凝膠狀懸浮培養(yǎng)于培養(yǎng)板中,相差顯微鏡下觀察可見細胞呈圓形,以三維立體方式均勻分散在膠原水凝膠中;培養(yǎng)7天后,HE染色可見肝細胞聚集生長,成纖維細胞則圍繞肝細胞生長,CK18染色陽性說明肝細胞未逆分化,仍保持成熟肝細胞表型,并且PAS染色及白蛋白免疫熒光染色陽性,提示細胞仍具有糖原及白蛋白合成功能。(2)按照H:F為1:0.5、1:1、1:2、1:4及1:8接種,檢測培養(yǎng)液

7、上清中白蛋白及尿素分泌含量結(jié)果顯示,培養(yǎng)后分泌水平逐漸上升,到第5或7天時達到高峰,后隨培養(yǎng)時間延長逐漸下降,但H:F為1:0.5組在20天內(nèi)白蛋白及尿素分泌含量仍分別維持在30-50μg/24h,40-110μg/24h的較高水平,與其它組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05);接種四種不同細胞密度后,細胞接種密度2×106/ml組白蛋白分泌及尿素合成能力最強,增加或減少細胞密度對肝細胞的功能沒有明顯作用,并且第7天的分泌含量與其余各組相比

8、具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);將細胞采用三種方式培養(yǎng),在培養(yǎng)第3天,各組白蛋白與尿素分泌含量無明顯差異,而在第7和第20天,共培養(yǎng)組的白蛋白分泌含量與單獨培養(yǎng)組及插入培養(yǎng)組相比明顯升高,第7天分別升高2.10及1.46倍,第20天分別升高4.58及1.75倍,尿素合成與白蛋白分泌趨勢類似。(3)使用最優(yōu)化條件培養(yǎng)肝細胞后,與單獨培養(yǎng)組相比,共培養(yǎng)組細胞存活率顯著升高(分別為52.25±4.62％及32.92±5.32%,P<0.01,

9、第20天),白蛋白分泌、尿素合成及LDL攝取能力增強,肝細胞特異基因表達(Albumin,HNF-4α,Claudin-3及G6P)明顯升高(P<0.05),并且肝藥酶誘導效果顯著,在誘導后CYP2E1表達明顯升高,與單獨培養(yǎng)相比結(jié)果有統(tǒng)計學差異,而CYP1A2,CYP2B2及CYP3A1在誘導后穩(wěn)定表達,CYP1A1則下降。
　　【結(jié)論】:以膠原水凝膠為支架成功構(gòu)建了肝細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng)。按照肝細胞與成纖維細胞比例為1:0.5、