扎考必利對哇巴因誘發(fā)成年大鼠心律失常的抑制作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　1.建立哇巴因（ouabain）誘發(fā)成年大鼠離體和在體心律失常模型,觀察內(nèi)向整流鉀通道激動劑扎考必利（zacopride）對模型大鼠心律失常的作用。
　　2.應用全細胞膜片鉗技術(shù),觀察zacopride對大鼠單個心室肌細胞膜內(nèi)向整流鉀電流（IK1）、靜息電位（RMP）及誘發(fā)延遲后除極（DADs）的影響,分析zacopride抗心律失常的電生理機制。
　　方法：
　　1.Ouabain誘發(fā)大鼠離體和在體

2、心律失常模型的建立
　?。?）Ouabain誘發(fā)大鼠離體心律失常模型
　　健康SD大鼠,50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,開胸游離心臟并且懸掛于Langendorff裝置上,使用低鉀臺氏液進行主動脈逆行灌流,流速為8 mL/min,觀察至少30 min待心電圖波形穩(wěn)定后使用給藥泵給藥。觀察各組大鼠心電圖變化,記錄藥物干預后30 min內(nèi)室性期前收縮的個數(shù)、室速和室顫持續(xù)時間及發(fā)生率。
　?。?）Ouabain誘

3、發(fā)大鼠在體心律失常模型
　　健康SD大鼠35只隨機分為5組,30 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠置于鼠板上,連接固定肢體導聯(lián)。采用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖,連續(xù)觀察30 min心電圖無異常后尾靜脈給藥,記錄藥物干預后1 h內(nèi)室性期前收縮的個數(shù)、室速和室顫持續(xù)時間及發(fā)生率。
　　2.大鼠單個心室肌細胞急性分離
　　健康SD大鼠,50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,頸動脈放血并且迅速

4、開胸取心臟,置于提前以100％氧氣沖灌的4℃無鈣臺氏液中進行修剪,然后將心臟懸掛于 Langendorff心臟灌流裝置上經(jīng)主動脈逆行灌流。首先用無鈣臺氏液灌流8～10 min后,再改用膠原酶液循環(huán)灌流15～20 min。在整個灌流過程中始終保持恒溫37℃,恒壓80 cmH2O,并持續(xù)以100%氧氣通氣。待心室肌組織變大變軟后選擇左心室剪下,置于KB液中剪碎,輕輕吹打3～5 min后經(jīng)150μm孔徑的濾網(wǎng)過濾得到單個心室肌細胞,保存于KB

5、液中,室溫放置3～4 h穩(wěn)定后進行實驗。
　　3.全細胞膜片鉗記錄
　　吸取預先存放于KB液中的細胞懸液1～2滴滴入倒置顯微鏡的細胞槽（約1 mL）中,靜置8～10 min,待細胞充分貼壁后,用含鈣臺氏液灌流復鈣,流速定為2 mL/min。玻璃電極內(nèi)充灌電極內(nèi)液,電阻約為2～5MΩ。鏡下選取長桿狀、橫紋清晰、無自主收縮的心室肌細胞作為實驗對象,將玻璃電極緩慢移至細胞表面,施加負壓從而在細胞膜和電極尖端之間形成高阻封接（即電阻

6、達到GΩ）,負壓破膜后采用膜電容補償和串聯(lián)電阻補償后進行全細胞記錄。相關(guān)離子電流經(jīng)Axopatch200B膜片鉗放大器、Digidate1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器以及Pclamp8.0采集、貯存及分析并且最終保存于電腦硬盤備用。記錄大鼠單個心室肌細胞IK1和RMP,并誘發(fā)DADs。
　　結(jié)果：
　　1.Zacopride對ouabain誘發(fā)成年大鼠離體心律失常具有顯著的抑制作用
　　1μmol/Lzacopride可顯著抑制

7、10μmol/L ouabain灌流誘發(fā)的離體大鼠心臟室性心律失常。在 ouabain組,給藥后30 min內(nèi)100%大鼠發(fā)生室速,持續(xù)時間（218.40±29.61）s；87.5%大鼠出現(xiàn)室顫,持續(xù)時間（10.71±2.90）s；期前收縮個數(shù)為751±24（n=8,P<0.01）。而ouabain+zacopride組,給藥后30 min完全消除了室顫的發(fā)生；25%大鼠發(fā)生室速,持續(xù)時間縮短至（18.85±12.40）s；期前收縮個數(shù)

8、減少至125±14（n=8,P<0.01）。在ouabain+zacopride混合灌流液中加入1μmol/L BaCl2后,通過比較發(fā)現(xiàn)期前收縮個數(shù)、室速室顫持續(xù)時間及發(fā)生率均與之前單獨灌流ouabain無統(tǒng)計學差異。
　　2.Zacopride對ouabain誘發(fā)成年大鼠在體心律失常具有顯著的抑制作用
　　15μg/kgzacopride可顯著抑制ouabain所致麻醉大鼠室性心律失常。在ouabain組,給藥后1小時內(nèi)

9、100%大鼠發(fā)生室速,持續(xù)時間（1250±59）s；71.4%大鼠出現(xiàn)室顫,持續(xù)時間（19.14±6.49） s；期前收縮個數(shù)為2281±115(n=7,P<0.01）。而ouabain+zacopride組,給藥后1小時完全消除了室顫的發(fā)生；28.6%大鼠發(fā)生室速,持續(xù)時間縮短至（15.57±10.10）s；期前收縮的個數(shù)減少至171±25（n=7,P<0.01）。其抗心律失常效應與陽性對照藥利多卡因（lidocaine,7.5mg/

10、kg）相似,甚至在控制期前收縮方面略優(yōu)于利多卡因（n=7,P<0.01）。
　　3.Zacopride可以逆轉(zhuǎn)ouabain對大鼠心室肌細胞IK1的抑制效應
　　10μmol/L ouabain灌流可使大鼠心室肌細胞IK1明顯減小,內(nèi)向電流（-100 mV）和外向電流（-60 mV）分別從（-10.69±0.21）pA/pF和（3.11±0.20）pA/pF降低到（-6.61±0.26）pA/pF和（1.97±0.17）pA

11、/pF（n=30,P<0.05）。在灌流液中加入了0.1～10μmol/Lzacopride后,IK1呈不同程度地恢復。其中,1μmol/L為zacopride的最大效應濃度，可以使IK1內(nèi)向電流（-100 mV）和外向電流（-60 mV）分別恢復到（-11.09±0.37） pA/pF和（3.29±0.31）pA/pF（n=12,P<0.05）,接近于對照組水平。該作用可被1μmol/L BaCl2阻斷,加入該濃度的阻斷劑混合灌流后,

12、心室肌細胞的內(nèi)向電流和外向電流均減小（n=12,P<0.01和P<0.05）。
　　4.Zacopride可以逆轉(zhuǎn)ouabain減小大鼠心室肌細胞RMP的作用
　　10μmol/L ouabain灌流可使大鼠心室肌細胞RMP從（-74.79±0.19）mV減小至（-70.27±0.21）mV(n=30,P<0.01)；給予0.1～10μmol/Lzacopride灌流后,減小的RMP呈不同程度恢復并且在1μmol/L時達最大

13、效應,使心室肌細胞 RMP恢復至（-74.98±0.44）mV（n=10,P<0.01）,接近于對照組水平。該作用可被1μmol/L BaCl2阻斷,給予該濃度的阻斷劑混合灌流后,心室肌細胞RMP最終減小至（-70.67±0.37） mV（n=10,P<0.01）,與ouabain組水平相似。
　　5.Zacopride對ouabain誘發(fā)大鼠心室肌細胞DADs的抑制作用
　　1μmol/Lzacopride可顯著抑制大鼠心

14、室肌細胞 DADs的發(fā)生,使其發(fā)生率由91.67%下降至12.5%（n=24,P<0.05）；在灌流液中加入1μmol/L BaCl2后,DADs再次出現(xiàn)。
　　結(jié)論：
　　1.內(nèi)向整流鉀通道激動劑zacopride對ouabain誘發(fā)的成年大鼠離體和在體室性心律失常具有顯著的抑制作用。
　　2.在0.1～10μmol/L范圍內(nèi),zacopride可不同程度地恢復ouabain灌流所減小的大鼠心室肌細胞 IK1和 RM