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文檔簡介
1、使用脫羰秋水仙堿(demecolcine)誘導卵母細胞去核能提高去核效率,降低去核操作復雜性,并由此獲得了克隆動物。但是近幾年市面上已經很難買到脫羰秋水仙堿,所以需要尋找新的藥物替代。我們用其類似物秋水仙堿(colchicine)(一種微管結構破壞劑)誘導小鼠卵母細胞去核,研究乙醇和SrCl2兩種激活處理方法對秋水仙堿誘導去核效率的影響,并摸索秋水仙堿誘導去核過程中最佳處理濃度和作用時間,篩選最佳去核方案。采用免疫熒光技術觀察比較秋水仙
2、堿作用于激活卵母細胞和未激活卵母細胞的微管結構不同之處。為了評價秋水仙堿處理對卵母細胞質量的影響,本研究利用酶聯(lián)免疫、定量PCR和熒光染色法檢測了卵母細胞胞質內MPF活性(與核重編程和細胞周期相關)、ROS濃度(與氧化應激相關)及Bcl-2(與細胞凋亡相關)表達量的變化。
本研究主要內容包括:⑴SrCl2激活組和乙醇激活組在配合0.6μg/mL秋水仙堿處理卵母細胞60min后獲得最高去核率,兩者之間差異顯著(34.38%,25
3、.36%)(P<0.05),乙醇激活組中部分未成功去核的卵母細胞胞質內含有核碎片。我們猜測SrCl2和乙醇對卵母細胞激活機制的不同是導致去核率差異顯著的原因。⑵免疫熒光結果顯示,完全去核卵母細胞呈現(xiàn)兩種形態(tài),一種是染色體隨第二極體完全排出,一種是染色體全部存在于卵母細胞皮質層形成的突起內。而突起部分會隨著秋水仙堿處理時間的延長發(fā)生回縮進胞質的現(xiàn)象,這可能是導致秋水仙堿去核率較低的原因。⑶秋水仙堿處理已激活卵母細胞后,胞質中微管結構徹底消
4、失,而處理未激活卵母細胞后,微管結構發(fā)生紊亂,但不會消失,該結果表明激活卵母細胞會協(xié)助秋水仙堿破壞微管結構。⑷秋水仙堿處理卵母細胞能夠在整體上顯著提高MPF活性值(P<0.05),抑制cyclinB1的水解,說明秋水仙堿處理能提高卵母細胞核重編程能力。⑸秋水仙堿處理未激活卵母細胞會顯著提高卵母細胞胞質內ROS濃度(P<0.05),且導致Bcl-2表達異常,而處理已激活卵母細胞會降低ROS濃度(P>0.05),且Bcl-2表達量較對照組顯
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