去透明帶倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞穿透試驗(yàn)

1、去透明帶倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞穿透試驗(yàn)去透明帶倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞穿透試驗(yàn)人精子與倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞融合的過(guò)程在功能上同與人卵母細(xì)胞融合的過(guò)程是一樣的，因?yàn)榕c卵母細(xì)胞質(zhì)膜融合的過(guò)程都是通過(guò)質(zhì)膜覆蓋在已發(fā)生頂體反應(yīng)的人精子赤道段而啟動(dòng)的。倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞穿透（HOP）試驗(yàn)，或稱(chēng)精子穿透試驗(yàn)，由于去除了透明帶，因此它不等同與生理狀態(tài)。此試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方案見(jiàn)后。注釋?zhuān)鹤⑨專(zhuān)撼Ｒ?guī)穿卵試驗(yàn)是依賴(lài)精子的自發(fā)性頂體反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的，這需要延長(zhǎng)精子在體外的孵育時(shí)間。由于此步驟不如生理過(guò)程

2、有效，且可能涉及不同的機(jī)制，因此常常出現(xiàn)假陰性結(jié)果（病人的精子在倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞穿透試驗(yàn)中失敗，而在體內(nèi)或體外可使人的卵母細(xì)胞授精，WHO，1986）。盡管如此，穿卵試驗(yàn)仍可以反應(yīng)獲能精子頭部質(zhì)膜與卵細(xì)胞膜發(fā)生融合能力的信息。繼精子透明帶之間的相互作用后，引起頂體反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)是鈣內(nèi)流和胞漿堿化，兩者均可由二價(jià)陽(yáng)離子載體A23187人工誘發(fā)。另一種方法是使用A23187激發(fā)的精子，該方法在文中亦有所描述。4.5.1實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)方案4.5.

3、1.1試劑試劑1BWW儲(chǔ)存液：見(jiàn)附錄4，A4.1節(jié)。2透明質(zhì)酸酶（300500IUmg）。3Ⅰ型胰酶（10000BAEEUmg）。4蠟塊（融點(diǎn)為4866℃）。5凡士林6礦物油7去除透明帶的倉(cāng)鼠卵：可購(gòu)買(mǎi)商品化的卵或通過(guò)對(duì)倉(cāng)鼠超排卵獲得。（見(jiàn)框4.1）8二甲基亞砜（DMSO）。9鈣離子載體（用于可選擇方案）1mm儲(chǔ)存液。4.5.1.2不用鈣離子載體的標(biāo)準(zhǔn)方案不用鈣離子載體的標(biāo)準(zhǔn)方案1將精液標(biāo)本混合均勻。（見(jiàn)框2.3）2用密度梯度離心法（見(jiàn)

4、5.5節(jié)）或上游法處理精液標(biāo)本（見(jiàn)5.4節(jié)）。3棄去大部分上清液，留下沉淀。12將精子液滴用礦物油覆蓋，詳細(xì)描述見(jiàn)4.5.1.2步驟11。注：注：鈣離子載體處理的劑量效應(yīng)曲線有個(gè)體差異，因此最好兩個(gè)濃度的鈣離子載體都檢測(cè)?？?.1倉(cāng)鼠誘導(dǎo)排卵倉(cāng)鼠誘導(dǎo)排卵確保注射活體動(dòng)物的流程都符合法律程序。準(zhǔn)備好合適劑量的孕馬血清（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素溶液。小量分裝后儲(chǔ)存于20℃?zhèn)溆谩＝?jīng)腹腔注射30單位PMSG給未成熟倉(cāng)鼠或動(dòng)情期第一天的成熟

5、倉(cāng)鼠。4872小時(shí)后，經(jīng)腹腔再注射40單位的hCG。用一只手抓住動(dòng)物背部并向腹部上方拉緊腹部皮膚，另一只手拿一個(gè)帶21號(hào)針頭的1ml注射器將激素注入倉(cāng)鼠腹腔（從髖關(guān)節(jié)上方進(jìn)針）。注射每只動(dòng)物都更換針頭，這樣易于穿透皮膚并減輕動(dòng)物的不適。4.5.1.4收集卵巢收集卵巢1注射hCG后18小時(shí)內(nèi)，按照動(dòng)物飼養(yǎng)使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方法處死動(dòng)物以回收卵母細(xì)胞。2倉(cāng)鼠腹部朝上放置，用95%（vv）酒精蘸濕腹部皮毛。3用齒鑷夾住皮膚，用剪刀剪開(kāi)皮膚和肌肉

6、，暴露子宮及卵巢。4用95%酒精擦拭鑷子和剪刀，擦凈上面的毛發(fā)。5將小腸拉出腹腔，暴露雙角子宮。6用鑷子夾住雙角子宮的一邊，將其拉出腹腔外以暴露輸卵管、卵巢及卵巢韌帶。7持住子宮最遠(yuǎn)端的位置，緊貼鑷子下方從子宮末端切斷。切下卵巢，放入裝有BWW液（37℃預(yù)溫）的Petri盤(pán)中。8以相同的方法收集另一個(gè)卵巢。4.5.1.5收集卵丘復(fù)合物收集卵丘復(fù)合物1在解剖顯微鏡下通過(guò)透視檢查卵巢，在輸卵管的膨大部位找到卵丘復(fù)合物。2用鑷子固定輸卵管，用