人類卵母細胞microRNA表達的初步研究.pdf

1、目的:
　　 1.基因芯片篩選人類卵母細胞從GV期到MII期microRNA譜的變化
　　 2.RT-PCR驗證基因芯片中卵母細胞差異表達的microRNA
　　 材料與方法:
　　 收集2008年8月～2010年2月在中山大學附屬第一醫(yī)院生殖中心行ICSI治療患者的不成熟卵母細胞。
　　 透明質(zhì)酸和機械法去除顆粒細胞后的卵母細胞放入trizol中-80℃保存。然后進行microRNA芯片實驗，檢

2、測GV與MII期卵母細胞microRNA的表達情況。GV期與MII期卵母細胞各三組，每組20個。共可獲6張芯片的數(shù)據(jù)。以倍數(shù)改變大于1.5倍，t檢驗中P＜0.05的基因定為有差異表達。
　　 應用單細胞熒光定量PCR技術(shù)在GV期和MII期驗證芯片結(jié)果。選擇了GV期到MII期表達水平發(fā)生上調(diào)變化的miR-602，以及發(fā)生下調(diào)變化的miR-15a和miR-20a。細胞保存條件：透明質(zhì)酸和機械法去除顆粒細胞，將單個卵母細胞放入溶解液中

3、，-20℃保存。
　　 驗證芯片實驗結(jié)果后，進一步檢測來源于以下4組的卵母細胞中miR-15a，miR-20a和miR-602的動態(tài)表達情況。
　　 GV組：ICSI患者GV期的卵母細胞；
　　 MI組：ICSI患者MI期的卵母細胞；
　　 MII組：TCM199+1.0iu/mlHCG+10％SPS+5.5 ng/ml FSH培養(yǎng)至MII期的卵母細胞；HMII組：TCM199+1.0iu/mlHCG+1

4、0％SPS+2000ng/ml FSH培養(yǎng)至MII期的卵母細胞實驗采用以質(zhì)量單位作為標準進行相對定量的△CT法和有參照基因的2-△△CT法兩種方法。統(tǒng)計分析采用t檢驗與one-way ANOVA方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計軟件采用SPSS.13.0。
　　 結(jié)果:
　　 在miRNA芯片的分析中，MII組與GV組相比，共有15個microRNA出現(xiàn)差異性表達，其中4個microRNA的表達發(fā)生了上調(diào)，11

5、個microRNA的表達下調(diào)。
　　 單細胞熒光定量PCR的結(jié)果中，MII組與GV組相比，hsa-miR-15a的平均倍數(shù)改變?yōu)?.19，芯片結(jié)果中的倍數(shù)改變?yōu)?.31；hsa-miR-20a的平均倍數(shù)改變?yōu)?.06，芯片結(jié)果中的倍數(shù)改變?yōu)?.47；hsa-miR-602的平均表達水平上調(diào)了5.28倍，而芯片結(jié)果中為上調(diào)5.01倍。定量PCR數(shù)據(jù)與芯片數(shù)據(jù)基本一致。
　　 在miR-15a，miR-20a和miR-602

6、的動態(tài)表達情況的研究中，與GV組相比，MI組、MII組和HMII組的hsa-miR-15a相對平均倍數(shù)改變分別為：1.380、0.074和0.155，其中MII組、HMII組的平均倍數(shù)改變均有顯著性差異(P值均小于0.001)。MII組和HMII組兩組比較中，HMII組的hsa-miR-15a表達水平高于MII組(P=0.034)。
　　 與GV組相比，MI組、MII組、HMII組的hsa-miR-20a相對平均倍數(shù)改變分別為：

7、1.074、0.060和0.320。其中MII組、HMII組的平均倍數(shù)改變均有顯著性差異(P值分別為小于0.001和0.022)。MII組和HMII兩組的比較中，HMII組的hsa-miR-20a表達水平高于MII組(P=0.003)。
　　 hsa-miR-602的表達水平在各組間也是呈動態(tài)改變的，其變化趨勢與芯片結(jié)果相吻合。
　　 與GV組相比，MI組、MII組、HMII組的hsa-miR-602的相對平均倍數(shù)改變分

8、別為：0.963、1.033和0.520，各組間平均倍數(shù)的改變無顯著性。以miR-16為內(nèi)參的兩次實驗表明，GV與MII組△CT的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)。MII與HMII兩組的比較中，MII組中hsa-miR-602的表達水平高于HMII組(P＜0.010)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在卵母細胞發(fā)育過程中，部分microRNA的表達有顯著的變化，并隨著減數(shù)分裂的不同階段呈動態(tài)改變。
　　 2.培養(yǎng)液中