MK和GM-CSFRα在胚胎干細胞中的表達與功能研究.pdf

1、胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)是一類來源于早期囊胚內細胞團(Inner cell mass，ICM)的多能性(Pludpotency)細胞群體．ESC依賴一個復雜的調控網絡維持其多能性的細胞狀態(tài)。而構成這一網絡的各種多能性相關分子共同決定著ESC的命運．當前已知的ESC多能性相關分子仍然十分有限，其功能研究也存在明顯不足．尋找新的多能性相關分子及其功能成為胚胎干細胞基礎理論研究的一個重要部分。同時ESC理論

2、研究的深入無疑也將大大推動ESC細胞治療和再生醫(yī)學應用的發(fā)展。
　　 中期因子(Midkine，MK)是一種分子量為13kDa的肝素結合生長因子，它在許多細胞中都有著重要的功能，包括促進細胞生長、抑制凋亡。MK最早在維甲酸（RA）誘導的小鼠胚胎癌細胞(mECC)中被發(fā)現。為了研究其在ESC中的功能，我們首先通過免疫細胞化學(ICC)和RT-PCR分析了ESC中MK的表達，并在小鼠胚胎干細胞(mESC)自發(fā)分化體系中探討了MK隨著

3、mESC分化的表達變化。隨后我們分別在有飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層mESC培養(yǎng)體系中比較了添加和不添加MK條件下mESC自我更新能力的差異．最后我們通過Westernblotting、流式細胞儀和細胞周期分析探討了MK作用于mESC的機理。結果表明MK及其受體PTP在mESC和人胚胎干細胞(hESC)中均存在強陽性表達．自發(fā)分化實驗進一步說明隨著分化的進行，MK的表達隨著mESC多能性的丟失而減弱。而外源添加高濃度的MK能有效促進mESC的增殖和

4、集落形成，并抑制其自發(fā)分化。這一作用的產生是由于添加的MK提高了mESC胞內AKT的磷酸化水平進而活化了PI3K/AKT信號通路，從而促進細胞周期由G1期向S期聚集，并減弱了mESC的自發(fā)凋亡．相反添加PI3K抑制劑LY294002有效阻斷了MK對mESC自我更新的這一促進作用。因此我們認為在mESC常規(guī)培養(yǎng)過程中，MK通過自分泌或旁分泌促進了ESC的自我更新。這一發(fā)現首次從蛋白水平證明了MK在ESC中的表達及功能，豐富了我們有關ESC

5、胞外因子微環(huán)境的知識．而ESC中MK/PTP~信號通路的揭示也將進一步加深我們對多能性調控機理的認識。
　　 抗體能識別其相應的抗原，且具有極高的特異性，因此利用單克隆抗體技術尋找新的ESC特異性功能分子無疑是多能性相關分子發(fā)現的另一條有效途徑．本研究中我們通過大劑量ESC活細胞免疫新西蘭大白兔，并經ICC篩選獲得了305個分泌mESC陽性單克隆抗體的雜交瘤細胞株，就我們所知這是目前最大的mESC特異性單克隆抗體庫。從中挑選出來

6、優(yōu)先研究的20個抗體展現了不同的ICC和流式染色，說明全細胞免疫產生兔單克隆抗體可作為細胞特異性抗體產生的有效方法，這20個抗體的ICC和流式細胞分析結果顯示了不同抗原在mESC中的不同表達比例，顯示了這些抗原在mESC中異質性的表達規(guī)律。而從中篩選得到的一個抗體，其抗原表達隨ESC的分化而降低，說明該抗原與ESC的多能性相關。進一步免疫沉淀(IP)提取抗原并經質譜鑒定表明該抗原為粒細胞．巨噬細胞集落刺激因子受體a(GM-CSFRa)。

7、這一新發(fā)現表達于ESC細胞膜表面的GM-CSFRa，其表達緊隨ESC的分化而快速下降，提示了它在ESC中發(fā)揮重要功能。
　　 ESC的理論研究為臨床應用打下了基礎，已有研究表明ROCK抑制劑Y-27632能有效促進單個分散hESC的存活，在我們的研究中，通過Y-27632的處理，成功誘導hESC分化為間充質干細胞(MSC)樣細胞。進一步的細胞表面標志分析和分化潛能分析表明我們分化得到的hESC來源的MSC(hESC-MSC)具有

8、成體MSC典型的細胞形態(tài)和表面標志（包括CD73、CDI05、CD166陽性而CD34陰性），并能有效分化為成骨和脂肪細胞。不僅如此，我們分化得到的hESC-MSC還表現出MSC類似的免疫調節(jié)特性，能在體外的混合淋巴反應中抑制淋巴細胞增殖。在CCI4誘導的小鼠肝炎癥模型中，能夠遷移到炎癥部位并在炎癥部位存活，進而抑制炎癥部位的淋巴細胞浸潤．我們獲得的hESC-MSC在異源性免疫勝任環(huán)境中的這一獨特的免疫調節(jié)能力，預示了它良好的應用前景．