TIPE2介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)在HCV致癌過程中的作用.pdf

1、背景：新型免疫調(diào)控因子TIPE2(Tumor necrosis factor–alpha-induced protein8-like2)是一種在炎癥反應(yīng)及免疫自穩(wěn)過程中不可或缺的負(fù)性調(diào)控因子。先前發(fā)現(xiàn)TIPE2在小鼠體內(nèi)的下調(diào)通常會(huì)導(dǎo)致致命性炎癥。隨著研究的進(jìn)一步深入，有報(bào)道稱TIPE2在人體內(nèi)往往和自身免疫性疾病相關(guān)，主要表達(dá)于免疫組織和細(xì)胞中；在一些非免疫組織及細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，包括肝細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，以及宮頸、胃腸道的上皮細(xì)胞等，

2、提示在人體的非免疫器官及細(xì)胞中，TIPE2也可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。
　　目的：闡明TIPE2在HCV感染后誘導(dǎo)腫瘤形成過程中所起的作用及分子機(jī)制。
　　方法：⑴收集HCV陽性肝癌病人標(biāo)本,包括癌組織及癌旁組織,利用Western blot比較TIPE2的表達(dá)差異。⑵以肝癌細(xì)胞系Huh7及正常肝細(xì)胞系Changliver為研究對象，分別建立TIPE2過表達(dá)及 TIPE2沉默穩(wěn)定株，繼而進(jìn)行生長曲線描繪、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)

3、等檢測TIPE2對肝癌細(xì)胞、正常肝細(xì)胞的增殖、克隆形成能力及劃痕愈合能力等的影響。⑶將上述建好的穩(wěn)定株對裸鼠進(jìn)行腋下注射，觀察裸鼠成瘤情況。⑷在293T細(xì)胞中將TIPE2分別與HCV編碼蛋白（包括NS3/4A、NS5A、NS5B等）共轉(zhuǎn)染，48h后Western blot檢測哪個(gè)（些）編碼蛋白對TIPE2的表達(dá)有影響。⑸在293T細(xì)胞中，將上述對TIPE2表達(dá)有影響的HCV編碼蛋白與TIPE2共轉(zhuǎn)染，利用免疫共沉淀和免疫熒光-激光共聚焦

4、檢測TIPE2與這些蛋白的相互作用情況。進(jìn)一步在Huh7細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。⑹將裸鼠的瘤組織進(jìn)行組織切片，檢測DNA損傷情況。⑺利用DNA損傷藥物HU處理TIPE2過表達(dá)及TIPE2沉默穩(wěn)定株，然后Western blot檢測過表達(dá)、沉默 TIPE2對DNA損傷/修復(fù)通路中關(guān)鍵蛋白 H2AX、Chk1、Chk2等的磷酸化水平是否有影響。
　　結(jié)果：①HCV陽性肝癌病人肝組織中TIPE2表達(dá)下調(diào)。②HCV編碼蛋白NS5A可以促使TIPE

5、2降解。③HCV編碼蛋白NS5A與TIPE2可以相互作用，且在胞漿共定位。④過表達(dá) TIPE2后，DNA損傷/修復(fù)通路中的關(guān)鍵分子γ-H2AX、pChk1與 pChk2表達(dá)明顯下降；沉默TIPE2后，γ-H2AX、pChk1與pChk2表達(dá)明顯上升。⑤過表達(dá)TIPE2后，細(xì)胞增殖速度、克隆形成能力及劃痕愈合能力顯著減弱。沉默TIPE2后，細(xì)胞增殖速度、克隆形成能力及劃痕愈合能力顯著增強(qiáng)。⑥裸鼠皮下注射TIPE2過表達(dá)及對照組穩(wěn)定株細(xì)胞后

6、，過表達(dá)組的成瘤能力明顯不及對照組；注射 TIPE2沉默及對照組穩(wěn)定株細(xì)胞后，沉默組的成瘤能力高于對照組。⑦檢測上述瘤組織中的DNA損傷情況，發(fā)現(xiàn)TIPE2過表達(dá)組未出現(xiàn)陽性著色顆粒，幾乎不存在 DNA損傷，而其相應(yīng)的對照組中則出現(xiàn)大量陽性顆粒，DNA損傷嚴(yán)重；相反，在 TIPE2沉默組其陽性著色顆粒明顯多于對照組，DNA損傷情況較對照組更為嚴(yán)重。
　　結(jié)論：依據(jù)上述結(jié)果可以得知：TIPE2可以通過調(diào)控DNA損傷/修復(fù)通路參與 H