L-型電壓依賴性鈣通道α1亞單位在兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞基質(zhì)代謝中的作用及其機制研究.pdf

1、膝骨關節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一種常見的以膝關節(jié)軟骨進行性退變?yōu)榈湫吞卣鞯穆躁P節(jié)疾病。盡管近年來KOA治療方法和手段不斷改進，但總體治療效果仍不理想，缺乏對KOA發(fā)病機制的深入理解是影響其治療效果的主要原因。
　　關節(jié)軟骨是骨性關節(jié)炎病變時最先和最主要的侵犯部位。關節(jié)軟骨包括軟骨細胞和細胞外基質(zhì)（主要是Ⅱ型膠原和蛋白聚糖）。骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)時，各種病理因素均直接或間接

2、地作用于軟骨細胞，使其調(diào)控的軟骨基質(zhì)合成與降解的動態(tài)平衡體系失衡，并最終導致軟骨基質(zhì)的破壞。目前認為，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin)參與并調(diào)控軟骨細胞增殖、分化，在關節(jié)軟骨的發(fā)育及骨關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。
　　離子通道(Ionic channels)是鑲嵌在細胞膜上的跨膜α-螺旋蛋白，允許特定的一些離子通過，是傳遞細胞內(nèi)外信號的重要途徑。軟骨細胞雖然不是可興奮性細胞，但是作為活細胞系統(tǒng)，越來越多的實驗證實

3、軟骨細胞膜具有靜息膜電位，并發(fā)現(xiàn)了形成靜息膜電位的多種通道和膜孔蛋白，如鈣激活的鉀通道，ATP敏感的鉀通道，電壓依賴性鉀通道，上皮鈉通道，電壓依賴性鈉通道，水通道，氯通道，NDMA受體(N-甲基-D-天門冬氨酸)，瞬時受體電位通道，電壓依賴性鈣通道等。雖然對每種通道的具體功能尚不完全清楚，但是可以肯定，細胞外各種機械刺激和生化的刺激信號會通過這些通道進而影響軟骨細胞的功能?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)多種離子通道調(diào)節(jié)劑對軟骨細胞膜電位產(chǎn)生影響，并影響了軟

4、骨細胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)在軟骨細胞膜上存在L-型鈣通道α1亞基Cav1.2蛋白的表達，使用鈣通道阻滯劑維拉帕米降低軟骨細胞膜電位達18％以上。電壓依賴性鈣通道在正常軟骨細胞中的功能如何？骨關節(jié)炎軟骨退變時，通道的改變以及調(diào)控機制如何？尚無相關研究報道。
　　采用膜片鉗，分子生物學和免疫學等方法，我們首次研究了KOA模型動物膝關節(jié)軟骨細胞各種電壓依賴性鈣通道α1亞單位mRNA的表達，并探討了病理情況下Calcinurin在L-型電壓

5、依賴性鈣離子通道調(diào)控兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞基質(zhì)代謝中的作用。研究正常和疾病狀態(tài)下軟骨細胞膜離子通道電生理特征的變化，開發(fā)作用于離子通道的藥物，可為臨床開發(fā)治療KOA提供新的藥物靶點，并對軟骨細胞移植及軟骨組織工程等相關技術的完善提供幫助。
　　第一部分兔膝骨性關節(jié)炎(KOA)模型制作及鑒定
　　目的:兔KOA模型制作及鑒定。
　　方法:采用經(jīng)典Hulth法，制作兔雙腿KOA模型。手術后12周，通過觀察關節(jié)大體情況，HE染

6、色、組織病理學Markin評分、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色、組織切片甲苯胺蘭染色和X線片對KOA模型的成功與否進行多方面鑒定。
　　結果:X線片可見，術后12w的KOA組動物膝關節(jié)內(nèi)股骨和脛骨邊緣骨贅形成;關節(jié)間隙不等寬，內(nèi)側較窄，關節(jié)面可見骨質(zhì)硬化。大體標本可見滑膜大部分呈結節(jié)樣增生，滑液混濁，軟骨表面有嚴重缺損及潰瘍形成，軟骨下骨暴露，裂紋邊緣軟骨變軟，表面粗糙，呈灰黃色，周圍有大量骨贅形成。HE染色可見軟骨損傷程度嚴重，大范圍

7、的軟骨纖維化，且達及深層，細胞數(shù)明顯減少，分布不均勻，潮線不連續(xù)，鈣化層難以分辨;基質(zhì)嚴重失染，Mankin評分13-14分。免疫組化發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原表達量比正常組明顯減少。組織切片甲苯胺藍染色發(fā)現(xiàn)軟骨組織比正常對照組染色程度明顯變淺。
　　結論:利用經(jīng)典Hulth法，成功建立了兔KOA模型。
　　第二部分兔KOA時軟骨細胞RT-qPCR內(nèi)參基因的選擇
　　目的:確定培養(yǎng)三代的軟骨細胞進行RT-qPCR實驗時最佳的內(nèi)參基因

8、。
　　方法:培養(yǎng)正常和KOA軟骨細胞，取前三代細胞，利用RT-qPCR技術對15種管家基因在各代軟骨細胞中的表達變化進行分析，通過geNorm與NormFinder軟件對管家基因進行穩(wěn)定性排序，然后用RefFinder軟件綜合上述兩種軟件得到的各基因穩(wěn)定值，對15種管家基因穩(wěn)定性進行綜合排序，得到KOA時最穩(wěn)定內(nèi)參基因。
　　結果:15個內(nèi)參基因表達存在差異，geNorm與NormFinder軟件結果略有不同，RefFin

9、der綜合結果得出一代最佳匹配基因為RPⅡ和YWHAZ，二代細胞為RPL13a和PPIA，三代細胞為RPL13a和RPⅡ，綜合前三代細胞RT-qPCR數(shù)據(jù)得到三代之前細胞穩(wěn)定內(nèi)參基因為YWHAZ和RPⅡ。
　　結論:確定培養(yǎng)三代的軟骨細胞進行RT-qPCR實驗時最佳的內(nèi)參基因。
　　第三部分電壓依賴性鈣離子通道α1亞單位在兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞基質(zhì)代謝中的作用
　　目的:探討KOA時軟骨細胞電壓依賴性鈣離子通道α1亞單位

10、與細胞基質(zhì)代謝的關系。
　　方法:采用膜片鉗技術，觀察了兔KOA軟骨細胞靜息電位的變化。應用RT-PCR技術，觀察了兔KOA軟骨細胞合成代謝和分解代謝指標的mRNA表達改變，以及各種電壓依賴性鈣通道α1亞單位mRNA表達的變化。
　　結果:(1)正常和KOA時軟骨細胞膜靜息電位的變化:正常兔軟骨細胞靜息電位平均值為-37 mV，OA組細胞為-28 mV。與正常細胞相比，KOA細胞呈去極化表現(xiàn)，靜息電位值升高了25.2％(P＜

11、0.01)。(2)正常和KOA時軟骨細胞電壓依賴性鈣離子通道α1亞單位mRNA的表達:本模型條件下，正常兔膝關節(jié)軟骨細胞僅有Cav1.2，Cav1.3，Cav1.4，Cav2.1，Cav2.2和Cav2.3的mRNA表達，未發(fā)現(xiàn)存在Cav1.1，Cav3.1和Cav3.3的mRNA表達。KOA時，軟骨細胞Cav1.3，Cav1.4和Cav2.1的mRNA表達增高，分別是正常軟骨細胞的4.37，8.96和3.63倍(P＜0.05，P＜0.

12、01)，Cav1.2，Cav2.2和Cav2.3的mRAN表達沒有明顯改變。(3)正常和KOA時軟骨細胞基質(zhì)合成代謝和分解代謝相關基因的mRNA表達:正常兔膝關節(jié)軟骨細胞均有選擇的10種目的基因mRNA的表達，與正常相比，軟骨細胞的合成代謝指標中ColⅡ，aggrecan-1，SOX-9和TGF-β的mRNA明顯降低。軟骨細胞的分解代謝指標中各種酶的mRNA表達增多，尤其是MMP-1，ADAMTS-4和ADAMTS-5增多顯著(P＜0.

13、05)。
　　結論:KOA時通過鈣通道增加的鈣可能是軟骨細胞基質(zhì)合成代謝減少，分解代謝增加的原因之一。
　　第四部分 Calcinuerin在L-型電壓依賴性鈣通道調(diào)控兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞基質(zhì)代謝中的作用
　　目的:探討L-型電壓依賴性鈣通道是否是通過Calcinuerin調(diào)節(jié)了軟骨細胞基質(zhì)代謝。
　　方法:使用RT-PCR方法，首先觀察了KOA時軟骨細胞CaN和5種NFAT亞型的mRNA表達情況，然后分別使用L

14、-型電壓依賴性鈣通道阻斷劑硝苯地平（10μM），CaN抑制劑環(huán)孢素A（CsA，1μM），觀察CaN在L-型電壓依賴性鈣通道調(diào)控兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞基質(zhì)代謝中的作用。
　　結果:(1)正常和KOA軟骨細胞CaN和各亞型NFAT的mRNA表達:正常和KOA兔CnAα，CnAβ，CnB以及5種NFAT的mRNA均有表達。與正常動物相比，KOA兔軟骨細胞CnB的mRNA表達沒有顯著性變化，而CnAα，CnAβ均顯著降低，分別是對照組的0.

15、50和0.57倍(P＜0.05)。5種NFAT的mRNA表達變化并不一致。NFATc1降低最為顯著，是正常的0.34倍(P＜0.01)，而NFATc2明顯升高，是正常組的2.42倍(P＜0.01)，NFATc3，NFATc4和NFATc5的mRNA表達雖有降低趨勢，但沒有顯著性意義。因此我們選取KOA中變化最為明顯的CnAα，CnAβ，NFATc1和NFATc2來進行下面的實驗。(2) MTS法測定藥物對細胞活力的影響:與同時期的溶劑對

16、照DMSO組相比，硝苯地平和CsA作用72 h后，對KOA軟骨細胞的活力沒有影響(P＞0.05)。(3)硝苯地平和CsA對兔膝骨關節(jié)炎軟骨細胞代謝的影響:與溶劑對照組的KOA細胞相比，硝苯地平完全阻斷了KOA軟骨細胞Cav1.2，Cav.1.3和Cav1.4的mRNA表達。10μM硝苯地平增加了軟骨細胞內(nèi)基質(zhì)成分ColⅡ、agg-1和TGF-β的mRNA表達，降低了分解基質(zhì)的酶MMP-1，ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達，分別是

17、對照組的7.48倍(P＜0.01)，5.16倍(P＜0.05)，4.81倍(P＜0.01)和0.17倍，0.34倍和0.10倍(P＜0.01)。1μM CsA降低了軟骨細胞ColⅡ的表達，升高了MMP-1的表達，是對照組的0.25倍和3.27倍(P＜0.01)。
　　與溶劑對照組的KOA細胞相比，10μ M硝苯地平明顯升高了CnAα的mRNA表達(P＜0.01)，是對照組的3.28倍，但是卻顯著降低了NFATc2的表達，是對照組的