炎性刺激因子對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察炎性刺激因子脂多糖（LPS）、4-(甲基亞硝氨基)-l-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）及LPS聯(lián)合NNK對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）增殖的影響，探討長(zhǎng)時(shí)間的炎性刺激對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白表達(dá)的影響，以及長(zhǎng)時(shí)間炎性刺激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞定向分化的影響。
　　方法：（1）本實(shí)驗(yàn)中所用到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）來(lái)源于SD大鼠，應(yīng)用全骨髓貼壁法體外培養(yǎng)

2、純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,使用含10％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，首次換液時(shí)間為取材24小時(shí)后，之后每隔3天換一次培養(yǎng)液，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合率達(dá)到70%至80%時(shí)，使用膠原蛋白酶消化，1:2傳代至新的培養(yǎng)瓶中，取第三代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。（2）應(yīng)用MTT法檢測(cè)炎性因子對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，以選擇最佳的孵育濃度，分為對(duì)照組、LPS組、NNK組、LPS聯(lián)合NNK組。（3）應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)

3、干細(xì)胞NF-κB、CUGBP1蛋白表達(dá)的位置的變化。（4）Western blot檢測(cè)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白表達(dá)量的變化。（5）應(yīng)用肝組織液誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞20天，靛青綠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化情況。
　　結(jié)果：（1）MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同組的炎性因子都能促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，其中以LPS12.5μg/ml、NNK10μg/ml、LPS12.5μg/ml聯(lián)合NNK

4、10μg/ml組對(duì)大鼠BMSCs增殖的促進(jìn)效果最明顯。（2）免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，炎性刺激后細(xì)胞內(nèi)NF-κB、CUGBP1蛋白的表達(dá)量和位置不同，LPS組、NNK組、LPS聯(lián)合NNK組的NF-κB表達(dá)量均增加，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，主要在細(xì)胞核中表達(dá)。炎性因子長(zhǎng)時(shí)間刺激后，表達(dá)量明顯增加。NNK組、LPS聯(lián)合NNK組CUGBP1蛋白的表達(dá)量明顯增加，孵育1天后主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)CUGBP1蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，

5、并且表達(dá)量明顯增加。（3）Western blot定量分析可見炎性刺激后LPS組、NNK組、LPS聯(lián)合NNK組 NF-κB、p-P38蛋白表達(dá)量增加，LPS和NNK聯(lián)合組高于LPS組和NNK組。炎性刺激后，LPS聯(lián)合NNK組CUGBP1蛋白表達(dá)量比LPS組和NNK組明顯增加。并且，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白表達(dá)增加更為明顯（4）靛青綠實(shí)驗(yàn)顯示，炎性刺激后，干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞的分化明顯減少，LPS聯(lián)合NNK

6、組的靛青綠攝取量明顯少于LPS組和NNK組。
　　結(jié)論：(1)炎性因子可能通過(guò)激活P38MAPK和NF-κB信號(hào)途徑促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。長(zhǎng)時(shí)間的炎性因子刺激，促進(jìn)了NF-κB、p-P38、CUGBP1蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)。(2)長(zhǎng)時(shí)間的炎性因子刺激后，炎性刺激組NF-κB、p-P38蛋白的表達(dá)量明顯增加NNK組、LPS聯(lián)合NNK組NF-κB、p-P38、CUGBP1的表達(dá)量明顯增加，并且聯(lián)合組明顯高于NNK組，揭示了L